国自然新贵+CNS顶刊宠儿— —“相分离”也能做生信？看这里，肿瘤预后+分型分析，6分+干湿结合思路给你打个样！

2024-04-28

常看小云公众号的粉丝朋友们，应该有发现小云会经常分享一些国自然热点，比如肿瘤免疫、细胞死亡、肿瘤代谢、表观遗传修饰等等~ ~

（2022年国自然热点方向，图片来源于网络）

但这么多国自然热点中有一个听起来好像跟生信完全不沾边的方向小云还没有推荐过，还经常出现在CNS顶刊中，它就是“相分离”，那它怎么拿来做生信呢？在看思路之前，还是先跟小云初步了解下什么是相分离？（ps：追新热点只要跟紧小云就可以啦，小云发现新方向会第一时间分享给粉丝朋友们的）

相分离 (phase separation)是将生物分子从均匀环境中分离成两种不同的相(凝聚相和稀相)的密度依赖性分离。生活中可以见到水上漂浮的油滴，就是一种相分离现象。一共两种相，即水和油，由于都是液体，也叫液液相分离（LLPS，liquid-liquid phase separation）。

Hyman和Brangwynne 2009年在Science发文章，提出了细胞内通过“相分离”，可以提供一种特定的方式让细胞内的特定分子聚集起来，从而在“混乱的”细胞内部形成一定“秩序”。相分离参与无膜器官的形成、信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活。相分离异常可能导致疾病发生，比如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。异常LLPS与癌症的几个特征广泛相关，包括持续增殖信号、生长抑制逃避、细胞死亡抵抗、端粒维持和DNA损伤修复。

大概了解了“相分离”与疾病的关系，那它又该怎么切入做生信呢？其实非常简单，在常规套路上，只需要换个“相分离基因集”就可以啦，还有专门的数据库PhaSepDB、DrLLPS，相当方便了！今天小云就分享一个6分+的干湿结合思路给小伙伴们打个样，文章做了肿瘤预后+分型分析+验证实验，创新性到位，数据也很丰富，值得一学！目前“相分离”做生信的还很少，小云已备好基因集，感兴趣的朋友抓紧行动，换个癌种去复现吧！

题目：一个与前列腺癌患者生化复发和肿瘤免疫环境相关液-液相分离相关指数
杂志：Int J Mol Sci.
影响因子：IF=6.208
发表时间：2023年3月

研究背景

生化复发(BCR)是一个表明前列腺癌(PCa)患者的预后不良的指标，然而，很少有公认的目标可以有助于预测前列腺癌患者的BCRFS。已有研究报道了液-液相分离（LLPS）在前列腺癌治疗和进展中的重要性，但集中探讨LLPS与PCa患者BCR之间相关性的研究仍然有限。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	样本信息
TCGA-PCa	TCGA	RNA-seq数据+临床信息（包含BCR数据）	405例前列腺癌病例样本
GSE70770	GEO	RNA-seq数据+临床信息（包含BCR数据）	203例前列腺癌样本
LLPS相关基因	PhaSepDB		961个基因

研究思路

首先筛选了差异表达的液-液相分离相关基因(DELRGs)，然后通过共识聚类分析确定了PCa的三个LLPS相关分子簇，并进行亚型间的预后分析和免疫浸润分析。再通过LASSO cox回归分析建立一个新的LLPS相关指数来预测生化复发(BCR)无瘤生存率(BCRFS)。随后探索了LLPS相关指数与分子亚型、肿瘤免疫微环境和药物敏感性的潜在相关性。最后，进行了关键基因FUS的实验验证，以验证FUS是PCa的潜在生物标志物。

主要结果

1. 基于液-液相分离的肿瘤分型分析

首先在TCGA队列中筛选获得了102个差异表达的液-液相分离相关基因(DELRGs)（图1A），随后进行了单变量Cox回归分析以筛选与无BCR生存率(BCRFS)相关的预后性DELRGs。基于这些基因进行一致性聚类分析，获得了3个基于LLPS的分子簇（图1B）。通过KM生存分析比较3个亚型间的预后差异（图1D），并比较3个亚型间的PD-1和PD-L1表达差异（图1E）。然后使用估计算法和CIBERSORT算法，分析不同LLPS相关分子簇间免疫浸润细胞（图2A）和肿瘤微环境评分的差异（图2B）。（ps：差异基因分析、cox回归分析、聚类分析、KM曲线绘制也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。

图1 基于液-液相分离的肿瘤分型分析

图2亚型间肿瘤微环境分析

2. 一种新的LLPS指数的开发和验证

首先在TCGA队列中进行单变量Cox分析，筛选得到13个BCR预后相关DELRGs（图3C）。然后再利用LASSO回归分析最终筛选出6个DELRGs，并构建了一个新的与LLPS相关的预后指数来预测前列腺癌患者的BCRFS（图3D, E）。根据风险评分中位数，将所有病例分为两个高风险和低风险评分亚组，进行KM生存分析并通过ROC曲线来评估其预测性能（图3A, B）。

图3 LLPS指数的开发和验证

3. 风险评分与临床病理特征、肿瘤干细胞与肿瘤免疫微环境的相关性分析

通过单变量和多变量回归进行独立预后分析，结果显示风险评分是PCa患者的独立预测因子（图4A, B）。随后分析了风险评分与一些临床病理特征（图4C）和干细胞评分的相关性（图4D, E）。利用ssGSEA分析来量化免疫功能，评估不同风险亚组间的免疫浸润情况（图4F）。（ps：多种免疫浸润分析也可以用云生信平台分析工具实现哦，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html，欢迎朋友们来探索~ ~）

图4 风险评分与临床病理特征、肿瘤干细胞与肿瘤免疫微环境的相关性分析

4. 关键基因表达和功能验证实验

作者通过qRT-PCR检测前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞中6个模型基因的mRNA表达水平（图5A），通过IHC染色来分析这些6个基因在前列腺增生和前列腺癌组织中蛋白表达的差异（图5B）。根据结果选择关键基因FUS作为后续实验目标，沉默其表达后，通过CCK8实验检测细胞增殖（图5C），Transwell实验检测细胞迁移和侵袭（图5E-H），流式检测细胞凋亡（图5I, K），结果显示，沉默FUS可以减少前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。