毕业就靠它了！机器学习+共表达网络，让miRNA测序数据开出新的道路！纯生信也能发9分+！

机器学习作为人工智能领域的核心技术之一，在医学科研领域也表现出了巨大的潜力，在现在生信文章中出现的频率越来越高！那么miRNA-seq测序分析和机器学习会碰出什么火花呢？。miRNA的整合网络和机器学习分析可以为疾病病理和预后/诊断性生物标志物提供见解~

今天馆长给大家带来一篇仅用生信分析（共表达网络+机器学习）识别AD生物标志物。这篇文章为什么纯生信的单基因分析能发表6分+呢？且听馆长细细道来~

1. 本研究使用脑组织miRNA序列作为发现数据集，进行共表达网络分析，以确定与AD、其神经病理学标志物和认知相关的网络模块；

2. 本文也进行了关键miRNA与AD、其神经病理标志物和认知的关联分析； 

3. 本文还使用ROS/MAP数据集和来自GEO的独立数据集进行了一致的miRNA共表达网络分析。此外，还使用一种机器学习方法来评估中枢miRNA对AD分类的性能。想要学习共表达网络+机器学习的小伙伴千万不要错过了~(ps：这篇文章思路比较简单，有没有给你带来一点启发呢？感兴趣的童鞋可以直接来找馆长！欢迎直接来公众号后台call！)。

   

l题目：miR-129-5p 作为阿尔茨海默病病理学和认知能力下降的生物标志物

l杂志：Alzheimer’s Research & Therapy

l影响因子：IF= 9.0

l发表时间：2024年1月

研究背景

阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的常见原因，由于涉及复杂的神经化学和遗传因素，确切的阿尔茨海默病的发病机制仍不清楚。失调microRNA (miRNA) 的表达是导致阿尔茨海默病基因表达变化的潜在机制。miRNA 是内源性单链 RNA 分子，长度约为 20-23个核苷酸，主要通过结合特定信使 RNA (mRNA) 的 3′-非翻译端来抑制其翻译区域（3′-UTR）。一些 miRNA 已被确定在阿尔茨海默病中失调，某些 miRNA 在大脑中高度表达。miRNA 的共表达网络和机器学习分析可以提供对 AD 病理学和预后/诊断生物标志物的见解。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
GSE157239	GEO	RNA-seq数据	8个没有认知障碍的（NCI）和8个AD患者
ROS/MAP cohorts	Accelerating Medicines Partnership	RNA-seq数据	102 NCI和177 AD患者

          

研究思路

使用来自宗教秩序研究和 Rush 记忆与衰老项目 (ROS/MAP) (N = 702) 的脑组织 miRNA 图谱作为一项发现，进行了共表达网络分析，以识别与 AD、其神经病理学标记物和认知相关的网络模块数据集。我们对中枢 miRNA 与 AD、其神经病理学标志物和认知进行了关联分析。选择hub miRNA的靶基因后，我们对hub miRNA与其靶基因进行关联分析，然后进行基于通路的富集分析。为了复制，我们使用 ROS/MAP 数据集和来自基因表达综合库 (GEO) 的独立数据集 (N = 16) 进行了一致的 miRNA 共表达网络分析。此外，我们采用机器学习方法来评估 hub miRNA 在 AD 分类中的性能。    

主要结果

1.miRNA差异表达分析

对来自 ROS/MAP 的 177 名 AD 和 102 名 NCI 受试者中的 309 种 miRNA 进行差异表达分析。发现 15 个 miRNA 与 AD显著相关（图 1），CERAD 和 Braak 阳性组中 miR-129-5p 和 miR-132 的表达水平均显著降低（图 1）。此外，miR-129-3p、miR-129-5p、miR-132、miR-133b、miR-410、miR-433和miR-504的表达水平较高，而miR-100的表达水平较低。此外，miR-129-3p、miR-129-5p 和 miR-132 的较高表达水平与整体认知能力纵向衰退的减慢显著相关。    

图1 miRNA与诊断、临床病理特征关联分析结果热图

2.共表达 miRNA 网络分析与 AD、CERAD、Braak 和认知相关的模块

根据 702 名受试者的 miRNA 表达谱使用 WGCNA构建了无标度共表达网络。选择软阈值功率值 β = 4，并确定了四个网络模块。M3 模块的 ME 值较低，与 AD 和 CERAD 的显著相关，但与 Braak 阶段无关。此外，M3 模块的 ME 值较低与最后的整体认知表现较低相关（图2）。miRNA 的富集分析显示，M3 与葡萄糖代谢高度相关，M1 和 M2 分别与先天免疫和胚胎发育密切相关。  

图2 模块特征基因与诊断及临床病理特征的关联分析结果

3.与 AD、CERAD、Braak和认知相关的核心miRNA

在AD相关的葡萄糖代谢途径富集的M3模块中，基于TOM的模块内连接性最高的前10个miRNA被确定为核心miRNA（图3）。在这 10 个 miRNA 中， miR-129-5p与 AD、CERAD 和 Braak 呈负相关，与认知水平和变化直接相关。miR-433和miR-221的高表达水平与AD发生呈负相关，而只有miR-433与更好的认知和较慢的认知衰退相关（图3）。相比之下，miR-200a 和 miR-1260 的高表达水平与 AD 高发生率、CERAD 较高和认知能力较低有关，但与 Braak 或认知能力下降无关。最后，miR-744 仅与较低的整体认知相关。    

图3 前10个关键候选miRNA与诊断及临床病理特征的关联分析结果

4.AD 相关关键miRNA的靶基因

从 miRDB 和 TargetScan 数据库中获得了 5 个 AD 相关关键miRNA（miR-129-5p、miR-433、miR-1260、miR-200a 和 miR-221）的靶基因。RNA-Seq 数据分析确定 189、101、310、591 和 73 个靶基因分别与 miR-129-5p、miR-433、miR-1260、miR-200a 和 miR-221 相应 miRNA 的表达水平显著相关。此外，RNA-Seq 数据分析确定了总共 22、3、12、30 和 25 个分别与 AD 显著相关的靶基因（miR-129-5p、miR-433、miR-1260、miR-200a 和 miR- 221）。

5.基于通路的靶基因富集分析

KEGG通路的富集分析显示，通过RNA-Seq分析鉴定出的5个AD相关关键miRNA的靶基因主要涉及以下通路：轴突引导、ErbB信号通路、MAPK信号通路，γ-氨基丁酸酸能突触、自噬、AMPK、mTOR信号通路和谷氨酸突触。基于GO-BP通路的富集分析表明，通过RNA-Seq鉴定出目标基因对 5 个 AD 相关中枢 miRNA 的分析富含以下途径：蛋白质磷酸化、神经系统发育、染色质组织和神经元迁移。   

6.来自两个独立数据集的 miRNA 图谱进行共识网络分析

选择共表达模块中的关键 miRNA 来评估独立数据集中 ROS/MAP 数据集中确定的 5 个 AD 相关关键 miRNA 的复制情况。

7.共识网络模块识别

对发现和复制数据集分别执行miRNA共表达网络的构建，并使用平均连锁层次聚类方法中的共识相异性度量来识别共识模块。选择β = 4 的软阈值，并确定了四个共识模块（图4）。所有共识模块在两个数据集中都有对应的模块，表明两个数据集中的共识模块结构相似（图4）。miRNA 组成的共识 CM0 模块未分配给其他模块。

 

图4 共识网络模块的识别

8.共识模块的保存

作者构建了共识 ME 网络来研究模块的表达模式是否彼此相关（图 5A、B）。进一步构建了发现数据集和复制数据集之间共识 ME 对之间相关性的保存网络，以了解两个数据集保存模式的变化（图 5C）。两个网络中所有共识 ME 对之间的保存网络 D 值为 0.88（图 5D），表明这些模块在两个独立的表达模式中得到了很好的保存。    

图5 共识模块特征基因网络的构建

9.跨两个独立数据集识别 AD 相关共识模块以及 AD 相关关键 miRNA 的复制

图 6 显示了模块临床特征热图，表明 AD 与两个独立数据集中的四个共识模块之间的关联。共识 CM2 和 CM3 模块的低 ME 值与 ROS/MAP 数据集中的 AD 显著相关。在 GEO 数据集中，虽然共识的 ME 值之间的关联CM2和CM3模块与AD不显著，效应大小和关联方向与ROS/MAP数据集中一致。在发现数据集 (ROS/MAP) 中确定的 5 个与 AD 相关的中枢 miRNA 中，miR-129-5p、miR-221 和 miR-200a 包含在 CM2 模块中。相关性分析表明，ROS/MAP 数据集中的 M3 模块与 ROS/MAP 和 GEO 组合数据集中的共识 CM2 模块具有很强的相关性。    

图6 共识模块特征基因与 ROS/MAP 队列、GEO (GSE157239) 队列中诊断的关联分析结果以及跨 ROS/MAP 和 GEO 数据集

10.AD 分类的机器学习分析

使用机器学习方法中的惩罚逻辑回归对 NCI 的 AD 进行分类用于评估五种不同的分类模型。10 倍交叉验证的结果如图 7 所示。模型 1（包括年龄、性别和 APOE ε4 携带者状态）的平均 AUC 值为 0.807（图 7A）。通过在模型 1 中添加 5 个 AD 相关关键miRNA 获得的模型 3 的平均 AUC 值显著增加至 0.870（图 7C），与模型 5 相当（图 7E）。仅包括五个与 AD 相关的关键 miRNA的模型 2 的平均 AUC 值为0.740，模型 4（包括所有 309 个 miRNA）AUC 值为 0.815（图 7B、D）。    

图7 使用机器学习方法中惩罚逻辑回归的ROC曲线和平均AUC

文章小结

这篇文章整合网络和机器学习分析识别了miRNA神经病理学标志物miR-129-5p，与AD和认知相关，这一发现增强了对AD发病机制的理解，对AD分类和作为潜在的诊断/预后生物标志物有很大的帮助，但是还需要进一步的研究来验证和阐明其潜在的机制。只用生信分析就能完成一篇8分+的纯数据分析文章，同学们只需要学会“共表达网络+机器学习”的方法，换个疾病寻找它的标志物叭！想复现的抓紧扫码联系馆长吧~~

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