同一份短读长数据、同一条参考序列，一个已知纯合替代位点在第一份结果里完全消失，第二份却明确报成 1/1。变化发生在哪里？我们安装 PanGenie 4.2.1，给两份输入面板分别建索引，用完全相同的四千八百条读段各做一次分型，只有面板是否收录那个位点发生变化。这次对照还能看到一个容易忽略的现象，两个相邻位点的基因型保持相同，但支持不同基因型的相对似然值发生了改变。PanGenie 官方文档
这项分析先要有一份候选等位清单
PanGenie 使用一份含已知等位和相位信息的面板，为新个体的短读段进行基因分型。它利用等位附近的短序列词统计以及面板中的单倍型联系，寻找能解释样本证据的基因型。预处理阶段读入参考和面板，确定候选及其短序列证据。样本阶段再读取测序数据，给这些已有候选分型。索引可以在沿用同一版面板的不同样本间复用，面板本身若发生变化，需要重新构建与它匹配的索引。官方索引和样本分型步骤
这也决定了输出该怎么读。一种情况是面板里有这个位点，工具有机会输出参考型、杂合、纯合替代或未判定。另一种是面板没有列出该候选，样本读段即使含替代碱基，也没有这样一行需要分型。拿到一个空结果时，只检查测序深度会漏掉这层边界。还应核对位点是否进入索引、面板中的替代等位是否与研究目标等价，以及参考版本和等位表示是否匹配。PanGenie 输入文件说明
实跑经验｜只把第 6001 位从面板里拿掉
我们生成一条一万二千碱基的参考序列，间隔两千碱基设置五个候选，给每个位点指定两条单倍型上的替代等位拷贝数，依次为零、一、二、一、零。再从两条真值序列各取两千四百条长一百五十碱基的人工读段，合计七十二万测序碱基，除以一万二千得到六十倍名义深度。两份面板都含两个已分相的二倍体样本，差别仅在是否包含正中间的候选。读段文件只生成一次，两轮分析使用同一路径。
| 检查项 | 面板不含第 6001 位 | 面板含第 6001 位 |
|---|---|---|
| 面板位点数与样本输出行数 | 4 和 4 | 5 和 5 |
| 第 6001 位样本基因型 | 没有此行 | 1/1，符合已知真值 |
| 第 6001 位短序列证据 | 无此位点记录 | UK 为 32，KC 为 47 |
| 共有的第 4001 和 8001 位 | 两处均为 0/1 | 两处仍为 0/1 |
中间这个位点参考碱基为 T，人工样本的两份拷贝都改成 A。加入面板后参考型、杂合与纯合替代的相对对数似然依次为负四十三点七九、负二十八点零七和零，最受支持的是纯合替代。面板文件中两名供体却各自只带一份替代等位，面板等位频率字段因此为零点五。样本的纯合替代基因型没有把这列数字改成一。一个描述的是面板背景，一个描述当前样本，读表时把它们写在不同栏可以避免按错分母。
UK 和 KC 为什么也不能当作普通深度
输出头说明 UK 是该位点的唯一短序列词总数，KC 是样本在该处的局部短序列覆盖。一个是有多少可区分的词，一个是测序数据里这些词所反映的覆盖，两者都没有直接告诉你“有几条独立读段完整跨过变异”。本例中名义深度为六十，特定位点的 KC 为四十七，二者不需要相等。构造读段时起始位置随机，局部抽样与整条参考的平均值自然可有差异，短序列还需满足建索引时的条件。
PanGenie-index -r ref.fa -v panel.vcf -o idx -k 31 -t 1 -e 100000
PanGenie -f idx -i reads.fa -s test -j 1 -t 1 -e 100000 -o sample
bcftools query -f '%CHROM\t%POS\t%REF\t%ALT\t%INFO/UK[\t%GT\t%KC\t%GL]\n' \
sample_genotyping.vcf
两条命令使用的哈希大小为小型人工数据显式设置。迁移到实际全基因组应按输入量调整，并确认读段压缩方式与版本要求匹配。做面板对照时应为两个版本分别使用独立索引前缀，把参考校验值、面板版本、建索引参数与输出 VCF 保存在一起。如果脚本用的是更新后的面板文件名，却继续引用旧索引，测序文件和命令都可以顺利运行，漏掉的新增位点却不会回来。
核查新增位点时还应固定比较的替代序列。一个多等位位点可能在两张表里都占同一坐标，其中一版却只收录部分替代。直接按坐标求交集会把缺失的等位算成已经覆盖。先对齐参考碱基，逐个比对替代序列和它在各条面板单倍型上的编号，再比较样本的等位拷贝数，能避免把名称相同但候选集合不同的记录混在一起。
相邻位点为什么也值得重新看一遍
第 4001 位在两轮都是杂合，局部词覆盖也都是五十三。但三个基因型的相对对数似然从第一轮的负二十八点六六、零、负四十四点六一，变为第二轮的负二十九点二六、零、负二十九点二一。在第 8001 位同样能看到似然变化。我们只动了面板，读段丝毫没有变化。这与方法利用邻近单倍型信息进行联合推断相符。仅依据本例无法把差异精确归因到某一个内部概率项，却足以说明用新面板回算时，不能预设“原有位点的所有字段都原样保留”。PanGenie 方法论文
项目更新面板时，先把新旧结果分成共有位点、新增候选、被移除候选和等位表示发生变化几组。对共有位点再分别报告基因型一致率、未判定比例和置信度变化。若目标是估计新发现的疾病相关等位在人群中的频率，应先验证它确实已进入面板，再说明有多少样本可分型、多少属于低证据样本。对于面板尚未覆盖的真实变异，需要另用适当的发现方法形成候选。从既有结果中搜不到，无法作为该样本为参考型的证据。
批量样本需要用新版单倍型面板重新分型时，可在云生信的生物信息分析服务器保留两套索引，对照新增位点和共有位点的结果。
