Xenium 换了细胞分割后，一个基因为什么从上皮跑到了免疫细胞？

对同一块组织重复使用两套细胞边界，基因甲在免疫细胞中突然变多了。此时有一个比重新聚类更快的办法，挑出位置没变的那几个转录本，看它们在两套边界下分别归给谁。Xenium Ranger 可以在同一实验结果上导入细胞或细胞核分割并重新汇总。分子位置、分割边界和细胞类型标签分别来自不同步骤，先弄清改了哪一层，才谈得上这个基因是否真有跨谱系表达。

先固定分子清单，再说明换的是哪种边界

保留原始分析包、图像坐标框架和本次要使用的分子集合。比较时要让两版使用相同的基因面板、质量阈值和转录本标识。官方算法说明中，构建细胞特征矩阵时采用质量值达到二十的转录本。在演示单个基因的改变时，还应单独识别阴性对照探针或其他控制特征。若一版用全部检测点、另一版只画通过阈值的分子，就同时改变了分子清单和边界，后续差值无法只归因于分割。Xenium Ranger 算法与分子计数说明

弄清输入来自核、整细胞掩膜、细胞多边形，还是已有的逐分子归属表。只提供核时，后续细胞边界可以由核向外扩展得到，提供整细胞结果则是在讨论另一种边界定义。导入已有逐分子归属时，还要确认转录本标识与原实验准确对应。三种路线都能得到一个按细胞汇总的表，差别在于“这枚分子为什么算进来”的证据来源。将输入类型和运行参数写进图注，比笼统说换了新版分割更有意义。导入核、细胞边界或转录本分配的官方流程

做一张分子去向表，不只比较两个总数

假定某视野里基因甲恰有一百枚符合筛选条件的分子，且已经通过组织和核位置追踪到了同一对相邻细胞。旧边界给上皮细胞六十枚、免疫细胞二十枚，另有二十枚未分配。新边界让上皮的八枚划入免疫细胞，让原来未分配的四枚划入上皮，其余分子不动。结果上皮得到五十六枚，免疫得到二十八枚，未分配十六枚。上皮表面上只减少四枚，实际离开它的却有八枚。

沿行读是原来这类分子的去向，沿列读是新归属的来源。教学算例中总体已分配比例从八成升到八成四，但这只说明更少分子落在所有细胞之外，不能说明那八个新进入免疫细胞的分子一定被分对。扩大边界就可以让分配率上升，同时也有机会把来自隔壁的信号带进来。比较方案时应同时报告留在原群、跨群转移和由未分配转入的数目。只看新矩阵每列总量会丢失这三个来源。

原来的细胞编号还能不能直接用

重新分割可能把一个原细胞拆成多个对象，也可能把两个相邻的核归进一个对象。即使前后都有一个叫十七号的细胞，也不能根据编号相同判定是同一实体。先在同一坐标系中叠加原始核图像和两套掩膜，检查核位置、轮廓重叠以及相邻细胞关系。可以先以较清楚的一对一匹配作示范，在单独的表中列出一对多、多对一和无法匹配的区域，避免为了画漂亮的一对一散点图而删除最容易出错的地方。

逐分子追踪时，以原实验的分子标识作连接键，并检查重复和缺失。用外连接先看清两版到底缺了什么，再对两侧都出现的分子编号建立去向表。下面假定两张经质量筛选的表都含分子标识和已经核实、可以跨版比较的细胞类别，分子未分配时类别为空。若某个分子只出现在一份文件中，应另查过滤原因，不能把它当作“分子仍在，但未分配”。

import pandas as pd

joint = old.merge(new, on="transcript_id", how="outer",
                  suffixes=("_old", "_new"), indicator=True,
                  validate="one_to_one")
print(joint["_merge"].value_counts())
both = joint.loc[joint["_merge"].eq("both")]
print(pd.crosstab(both["cell_type_old"].fillna("unassigned"),
                  both["cell_type_new"].fillna("unassigned")))

实跑经验｜追踪五万条公开乳腺组织分子记录

我们用 pandas 3.1.1 读取官方人乳腺癌样本第一个技术重复的转录本文件，固定取文件开头五万条。五万条编号互不重复，通过质量值二十这一门槛的有 41,025 条，其中十九条为对照特征。其余 41,006 条进入比较。这个早期文件用负一表示未分配，如果只找空值，会把原本没有所属细胞的九十四条也算成已分配。复用文中的连接代码时，要先把当前版本文件中的未分配标识转成统一的空值。该样本的原研究数据和文件来源 · 所用文件的列定义

这次我们保留原有细胞编号，做一次可重复的口径对照。原来归属于细胞的有 40,912 条，如果进一步要求该转录本带有落在核内的标记，只剩 18,853 条。两者相差的 22,059 条仍在原文件中，只是被这条额外的筛选条件排除。其中 SCD 有 3,528 条。这里比较的是同一版边界下整细胞和核内标记两种口径，没有运行新的细胞分割，也不能把筛掉的读数解释成原分割错误。文件前五万行是可复取的位置片段，不能代表整张切片的分子比例。拿到两版真正的分割时，也可以先固定同一批编号，用同样的守恒关系追查差额，再决定要花时间查看哪一块组织。

在组织边缘和细胞接触处看哪些证据

挑一块核边界清楚、细胞排列疏松的区域，再挑一块上皮和免疫细胞紧贴的区域。分别以同样大小的视野、同样质量阈值画出基因甲和几种独立谱系标记的分子点。若新增信号都沿着两细胞相接的一条细边，且主要邻近强表达的上皮细胞，优先考虑跨界分配。若多枚免疫细胞内部、远离可疑接触边缘仍可观察到成组信号，并能在其他切片复现，才更值得进一步核实真实表达。细胞膜染色、独立探针或蛋白检测都可以提供不同层面的证据。

多边形和像素掩膜也有细节。外部图像生成的多边形可能包含重叠像素，算法在导入时会对不明确区域进行处理。切勿假定在绘图软件中视觉上“两个轮廓几乎不碰”就等于所有分子有唯一归属。先查算法报告中的重叠和异常对象，再在最敏感的接触面核对。若外部软件使用像素坐标，而分子表使用微米，还应确认变换、原点和旋转都已正确应用。大范围整体平移时，先修几何配准，局部调整细胞扩张距离不能纠正整张图错位。

最终写结果可以明确指出，在固定分子集合上，有多少变化来自分割，有多少细胞存在匹配歧义，哪些标记和独立图像支持新的判断。这样的报告能让实验人员直接选出复核的细胞和视野。多切片需要保留分子级原始数据和多套分割结果供团队对照时，可了解云生信的生物信息分析服务器。