一张空间图显示肿瘤细胞与巨噬细胞相邻富集。把建图半径从十微米调到三十微米，原来的红色区域却几乎消失。两组结果未必矛盾，十微米和三十微米可能在回答两个不同的组织学问题。判断之前，最好先从真实坐标画出一小块邻居边，算清用了多大的邻近尺度，再回来看富集分数的分母。下面用排成一行的四个点，重现仅改变半径就足以改变结果的原因。
先决定邻近指细胞接触、局部共居还是同处一个区域
在成像数据里，细胞质轮廓真正接触，细胞中心未必特别近。大细胞和小细胞的中心距离恰好一样，也可能有完全不同的边界关系。若要研究接触依赖的信号，质心半径只能作为近似，有边界时可进一步核对轮廓。若问题是某类细胞是否聚在同一血管周围，则较大的物理半径可能更贴近问题。先根据组织尺度确定要描述什么，后面改变半径才有解释对象。
从空间对象读取坐标后要查单位。图像像素和微米之间需要实际校准，缩略图上的像素也未必等于原图像素。多个切片经常各自把左上角记为零，直接拼接坐标会造成不同切片的细胞变成近邻。建图时让每张切片独立，检查最终邻接矩阵中是否有跨切片边。即使将不同切片在画布上平移开，也应该把来源字段保存下来，不能依赖一张临时排版图的坐标间距来定义真实组织邻居。Squidpy 半径建图的参数与距离定义
用四个点手算邻居边与随机基线
设一行四个细胞中心分别在零、十、二十、三十微米处，类型从左到右为甲、乙、甲、乙。设半径包含恰好等于阈值的点，不保留自环，每对无向邻居只数一次。十微米时只有三对相邻位置，每一对都是甲乙。二十一微米时还会加上第一与第三、第二与第四这两对同类细胞，总边数从三变成五，甲乙边数仍为三。
| 半径 | 无向边数 | 甲乙边数 | 甲乙边占比 |
|---|---|---|---|
| 10 微米 | 3 | 3 | 100% |
| 21 微米 | 5 | 3 | 60% |
| 31 微米 | 6 | 4 | 约 67% |
四个点中两甲两乙，如果将四个现有标签随机分配到四个固定位置，两两任选共有六种配对，其中四种跨类型。对于固定图里的任何一条无向边，随机时异类的预期概率都是三分之二。因此十微米图的随机预期是两条甲乙边，实际观察到三条，二十一微米图的预期为五乘三分之二，实际只有三条，到三十一微米时图已经完全连通，无论如何打乱标签，甲乙边都恰好四条。这个极端情况下置换标准差为零，不能再靠标准化分数区分任何空间排列。
手算的是无向总体边。软件输出按来源类型与邻居类型组织，某些读法还会区分甲到乙与乙到甲，以及同类型边在对称矩阵中的两端。作核对时始终保持计数口径一致。置换标准分反映观测与置换均值之间相差多少个置换标准差，绝不是“相邻概率为多少”。同一份数据里稀有群和丰富群拥有的可用边数差很多，两张都为深红色的格子也可能对应截然不同的绝对边数。Squidpy 邻域富集的计数与置换输出
建图后先查有没有跨片的边
下例假设所用 Squidpy 版本提供半径建图接口，坐标已换为微米，切片编号和类型已设为类别列。示范半径用二十一，与上表对应。邻接是按切片构造的，随后统计时仍提供切片编号，以便在相应切片内对标签作置换。代码先检查边的两个端点是否真的来自同一张切片，再计算富集。
import squidpy as sq
sq.gr.spatial_neighbors_radius(adata, spatial_key="spatial_um", radius=21,
library_key="slide")
graph = adata.obsp["spatial_connectivities"].tocoo()
slide = adata.obs["slide"].to_numpy()
assert (slide[graph.row] == slide[graph.col]).all()
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="cell_type", library_key="slide")
另一项检查是每张切片的度分布，也就是每个细胞有多少条邻居边。组织边缘和切割孔洞附近的细胞容易天然少邻居，密集肿瘤巢的中心则可能有很多。若图连线显著跨过空腔或组织裂隙，欧氏距离虽短，生物学路径却未必存在。画几块组织实景，把边覆盖在掩膜上检查，再决定需不需要排除跨空白的连线，或改用能够反映组织结构的邻接定义。
实跑经验｜漏填切片列，十条跨片边进入了结果
我们安装 Squidpy 1.8.4，把前面四点的视野复制成两张坐标完全重合的模拟切片。先传入切片编号分别构图，再用稀疏矩阵上三角数无向边。半径为十、二十一和三十一微米时，两片合计分别有六条、十条和十二条边，异类边分别是六条、六条和八条。半径二十一时，软件返回的有向计数矩阵两行分别为“四、六”和“六、四”，四个格子加起来为二十，正好是十条无向边的两倍。与手算比对时，只取一个三角的总边或先说明计数方向，便不会把这个倍数当成软件多连了边。
在各片内部置换标签，固定种子三十七，做二百五十六次。甲到乙的标准分从半径十时约 1.76，变为半径二十一时约 −1.09，最大半径下四个格子全都得到非有限值。此时每片已经完全连通，换标签确实改变不了甲乙边总数。最后只改一个参数，拿掉切片编号，在半径十重新构图。总边数增加到十六条，其中十条跨越了两张物理上互不接触的切片。同一坐标出现大量近邻时，检查边两端的样本编号比目测平面散点图更直接。
区分组织结构和同一组织区内部的偏好
如果甲乙都偏爱肿瘤边缘，即使它们在边缘内部并不特别靠近，拿整张切片随机打乱标签也可能得到明显富集。把问题改成“在同一组织区域内部，两者是否仍然彼此接近”，就需要在合适的区域内比较或设计保留组织分区的置换。若单独裁出区域，应说明是否保留跨区域的边、边缘点如何处理。不同空模型保留的结构不同，得到不同结论正好有助于辨认信号是由大尺度组织分布，还是更局部的相互邻近推动。
最后逐张切片汇总真实边数、预期边数、细胞类型占比及候选方向，再核对不同供体是否复现。拥有十万枚细胞的一张切片也只代表其实际取材来源。若要推广到某一类患者，把独立供体和组织区域交代清楚，比只报告一个很高的置换分数更能让读者判断证据。需要在多切片上反复构图、共享坐标和置换流程时，可了解云生信的生物信息分析服务器。
