Giotto Suite 里一个分子算在哪个细胞？先把焦面和边界对上

同一块组织，按细胞统计时某个标记有几十个分子，改按细胞核统计就只剩几个。还有一种更隐蔽的情况，明明以为只分析一个焦面，算出的结果却把不同深度的分子投在同一张平面上。Giotto Suite 可以同时保存图像、分子点坐标和多个空间单位的多边形，这给了研究者很大的选择余地。第一步是明确统计中的一个观测究竟代表整细胞、一个核、一个焦面轮廓，还是一个固定大小的网格。

从一个真实的分子点向外追查

挑一个目标基因的分子，先记录其物理坐标、焦面或深度、实验视野和唯一标识。再取同一视野的细胞与核多边形，检查二者采用的单位和原点。外部图像分析软件有时输出像素位置，分子表可能用微米。若一侧用整张拼接图原点、另一侧用裁剪区域左上角，就算两个数都叫横纵坐标，也不在同一个参考框架里。先找三个不共线地标作配准，再谈分子归属。

Giotto 的空间单位可以并存。一个细胞有自己的边界和编号，与其关联的核有另一套边界和编号。同一个分子若既位于核里也位于整细胞里，在核矩阵和细胞矩阵中各计一次本来合理，因为它们是对同一对象的两种测量范围。若误把两张矩阵按细胞名对齐后直接相加，核内分子就会被重复计算。要计算胞质分子，需在同一细胞、相同焦面和明确的包含关系下求差，或者直接在对应几何区域重新统计。Giotto 空间聚合的官方示例

四个分子演示焦面和几何范围怎样改变结果

设有一份简化的三维成像数据。零号焦面上一枚细胞的范围用横纵坐标均在零到十之间的方形代替，核的范围是横纵坐标均在四到六之间。这个细胞形状是教学近似。表里四枚都是同一基因的分子，我们要问的是，哪些能计入“零号焦面上的这枚细胞”以及其中的核。

筛定零号面后，这枚细胞计两个，核计一个。如果把不同焦面的所有分子先投到平面，再套用零号面的轮廓，就会把丙也纳入，整细胞计三个，核计两个。这个差值直接来自筛选条件，不能用来说明基因发生核内富集。反过来，若本来的目标就是做全厚度投影，也可以做，但应使用与投影目的相匹配的分割、去重和编号方案，清楚告诉读者实际在数什么。仅凭平面横纵坐标恰好重合也不应把甲与丙当作同一次检测，因为分子标识和焦面不同。

用匹配的焦面计算点与多边形的重叠

官方示例可以显式选取一组多边形，同时限制特征点的深度字段，然后将重叠结果转成计数矩阵。下例假定对象的边界集名称就是零号焦面，特征点中有相应的深度列，当前特征类型为待统计的分子。实际项目要先查对象中存的名称和取值，不能因为示例叫零号就套在所有仪器输出上。深度可能是焦面编号，也可能是连续的物理坐标，需要据此选择匹配方式。重叠计算参数 · 重叠结果如何转成矩阵

library(Giotto)
g0 <- calculateOverlap(g, spatial_info = "z0",
                       feat_subset_column = "global_z",
                       feat_subset_ids = 0)
g0 <- overlapToMatrix(g0)

对整个切片汇总前，可以抽十个结构较清楚的细胞，手工绘制几个代表基因的分子和轮廓。至少能回答这些问题，点是否集中在预期区域，外部点是否被误计，有没有相邻边界交叠，以及同一条分子标识是否被多个同级对象重复领取。若多边形相互交叠，不能默认任一项目都会替你用同一种规则选择所属细胞。应查看重叠关系和最终矩阵，明确保留冲突、排除冲突还是按有依据的方式裁决，并报告受影响的分子数。

实跑经验｜返回三行，并不等于三个分子都在细胞里

我们在 R 4.3.3 中安装了 Giotto Suite 的对象与重叠计算组件 GiottoClass 0.3.5，配合 terra 1.7.65 将表中的四枚分子建成点，分别与方形细胞和核的多边形相交。采用该版本面向空间向量的重叠函数，指定深度列为焦面编号并筛选零号后，细胞内返回有效编号的是甲和乙，核内只有甲。保留所有焦面时，丙同时进入了这枚细胞和核的二维范围，丁始终在界外。这样只改深度筛选就能重现前面的手算。本次所用 GiottoClass 版本的重叠计算实现

输出还暴露了一个很容易漏掉的差别。筛选零号面后，细胞结果对象有三行，核结果对象也有三行，因为这一调用保留了待判断的点。真正可以算作归属的，分别只有两个和一个，其余行的多边形标识缺失。如果直接用结果行数填进表达矩阵，就会把界外的丁也统计进去。拿真实样本时，先沿着一枚明确在内、一枚明确在外以及一枚不同深度的分子打印归属列再汇总。版本、几何对象类型和是否返回未命中行都可能影响读表方式，这三个对照比只检查总计更灵敏。

用守恒检查定位重复、遗漏和错误归并

在同一焦面选同一批分子，把它们按唯一标识分成没有落入任何细胞、落入恰好一个细胞、落入多个细胞三类。三类的数量之和应等于这批符合条件的唯一分子数。若某批一百枚分子中八十枚唯一归属、十五枚无归属、五枚各同时落入两个边界，那么保留全部点–边界映射时将有九十条关系。这里八十五枚至少归属一个细胞，九十是关系条数，分母又各不相同。直接看矩阵总数便无法分辨重复计入来自哪一行。

跨视野拼接时，也做同样检查。两个视野可能重叠，同一细胞在不同视野本地编号可能相同或不同，本地编号相同却也可能代表相距很远的两枚细胞。先给视野和层级加上可追溯标识，再判断是否真要合并。若依据物理重叠去重，保留旧对象与合并对象的对应表，不要先把本地编号去掉再尝试推测来源。比较两个区域的核内表达比例时，还要注意组织厚度、细胞截面大小和筛选后的可用分子数是否明显不同。

最后把一个可复验的小视野连同分子坐标、空间单位名称、所选焦面和归属表一起保存。换一种核边界后，读者就能判断差别来自核形状、分子筛选还是统计口径。多视野和多焦面对象需要统一管理、让团队重复计算不同空间单位时，可了解云生信的生物信息分析服务器。