BayesSpace 把 64 个点细分成 256 格，哪些变化能写进结果？

把一幅空间转录组图放大，原来一个颜色的点里出现两种颜色，交界处像是浮现了一条窄带。要向病理同事解释这幅图，首先要知道窄带靠什么信息画出来。从组织切片上捕获分子的仍是原来的点位。BayesSpace 把这些点位的表达降到低维，并让邻近位置的分群互相提供信息。细分后得到的是模型对原点内部表达结构的估计。判断窄带是否值得追踪，可以分开检查原始点位的证据、随机重复的稳定性，以及组织图上能独立辨认的结构。BayesSpace 方法与适用数据

先把格点、照片和表达矩阵对齐

先从组织中间和边缘各抽几枚条形码，记录表达矩阵中的列名、芯片阵列行列号和照片中的像素坐标。阵列行列描述捕获点之间的邻接关系，像素坐标把这些捕获点放回照片。照片即使裁过，阵列的邻接关系也可能完全正确，反过来，在图上摆得整齐的点也可能被喂给模型一套错误的平台几何。对历史 ST 方格数据和常见的 Visium 六角点阵，应分别核对平台参数。手工拼装对象时，不能从坐标碰巧有两列便推断两者可以通用。教程也单独说明了 Visium 做细分时所需的图像坐标。作者教程中的输入要求

对照原图还有一个具体做法。先画所有捕获点，再突出显示通过组织过滤的点，观察组织内空洞两侧实际相隔多远。若某点在表达矩阵里因低质量被删除，就应从对应的观察位置清单追踪删除原因。分析人员若重新编号后按行号拼接，有可能把原点的预测结果挪到相邻位置。拿三个布局不对称的组织特征检查坐标比对着画布四边找越界灵敏，例如缺口、折角和一块偏心的空白。把原点条形码保留到导出文件，别人才能在照片上定位到同一个位置。

分群数和空间平滑各自改变什么

空间模型的吸引力在于，相邻点位常共享组织结构。在弱信号区域，邻域可以让支离的小块聚成可解释的带状结构。在非常薄的组织层或罕见小灶上，同一性质也会让孤立但真实的信号被周围组织拉回去。初次分析应同时画出基于表达的初始分群和加入空间信息后的分群，再查发生更换的点集中在哪里。若改动几乎只在低计数的组织边缘，这与组织内部一条已知标记都支持的薄层消失，值得采取的复核措施显然不同。

分群数也会影响边界。作者的调参函数可以比较不同分群数下的平均伪对数似然，用曲线弯折的位置选择几组候选。实务中可以保留弯折左右各一组，将同一个组织内部区域和可辨认的交界区域分别圈定，查看增加一类到底拆开了哪块组织。若一小块区域只在某个分群数和某次初始化中出现，可把它列作待复验的候选。把所有参数都调到最贴合一张已知染色图，随后再以同一张图证明模型足够准确，会削弱验证的独立性。

实跑经验｜子点多了四倍，两个随机起点给出怎样的分群

我们在 R 4.5.2 安装 BayesSpace 1.20.2，用包内示例函数生成八行八列的方形阵列、八十个基因和八个主成分。该例的表达是模拟数据，没有一条已知的组织边界供模型恢复。固定同一个输入对象，设三类、取五个主成分，分别用随机种子三十七和九十三运行空间分群。每条链运行三百次迭代，烧入一百次。这是故意做短的教学试验，用来检查输出字段、随机起点和子点索引。作者教程中给实际分析的迭代建议远高于这里的设置，切片分析应进一步检查多条链的表现。教程中的迭代设置和收敛检查

两次输出的类别编号可以整体交换，所以直接数标签相等的点会误导。我们改为取任意两枚父点，比较两条链是否同意这两枚点归为一类或分属不同类。在全部两千零一十六对中，有一千五百二十一对判断相同，粗看一致率约为百分之七十五。再算考虑类别规模和偶然一致的调整兰德指数，结果为零。两个数字可以同时成立。若结果中有一类占了大量点，很多成对判断本来就容易一致。在无组织真值的模拟对象上，仅凭一个好看的百分比，无法给某条边界命名。读实际切片时，除了全图指标，还应圈出最关注的交界位置，看同一批原点能否重复聚在一起。

# one 和 two 为两次 spatialCluster 的输出，hi 为 spatialEnhance 的输出
a <- one$spatial.cluster
b <- two$spatial.cluster
stopifnot(identical(colnames(one), colnames(two)))
mclust::adjustedRandIndex(a, b)
table(table(hi$spot.idx))
dim(SingleCellExperiment::reducedDim(hi, "PCA"))
SummarizedExperiment::assayNames(hi)

取第一次分群继续做细分，在方格每条边上分成两段，输出二百五十六个子点。按父点索引分组，六十四个父点恰好各有四个子点。增强对象的主成分矩阵为二百五十六行、五列，本次返回的表达测定矩阵名称列表为空。这一步输出里无法直接找到某基因在每个子格的原始分子数。若另做特征增强预测，图例要写明预测的是哪种表达量，并与原始父点表达并排展示。若想进一步检验基因的空间定位，可以在邻近切片做独立成像，尤其关注模型预测有分界、原始组织观感又不明确的位置。

同事拿到图后应当能够回到哪一步

提交结果时，可以在一个窄边界和一个均匀内部区各选几枚父点，给出父点条形码、原始标记分子数、两条链的父点标签以及子点归属。边界附近若出现稳定分割，且独立成像捕捉到相邻两侧不同的标记组合，就有理由安排更精细的验证。若单次主图很清楚，但换随机起点后交界位置大幅变化，保留原点尺度来陈述发现会更合适。一张小范围放大图配上这些父点记录，比仅导出一幅更密的彩色散点图更便于同行复核。

多张切片需要比较分群数、随机起点和迭代长度时，可以先用一张代表性切片确定检查方式，再安排整批运行。需要保存各条链和中间对象的研究团队，可了解云生信的生物信息分析服务器。