一份组装交付物有两个 FASTA。主结果只有八万碱基，而输入样本明明还有一段一万八千碱基的模板。另一个文件标着未组装，里面三段长度相加却有两万六千多。单看任何一个数字都很难解释。我们实际运行 Canu 的高准确长读段模式，追踪每个片段用了多少条读段，取得共识前后的两阶段报告，并把结果比回已知模板。原来“这段序列有证据”“这段被组装成一个连续分子”和“这段被纳入主结果”能有三个不同答案。Canu 官方分析教程
让同一样本里同时出现深覆盖和浅覆盖
生成两条线性随机序列，大的一条长八万，小的一条长一万八千。长模板抽取四百二十条无错长读段，除少量读段固定触及两端，其余起点随机。短模板只取七条，每条仍有五千到六千八百个碱基，起点沿模板分开摆放，首尾都有人覆盖，中间片段有重叠。两份读段合并后一起组装，程序没有得到模板身份或序列。这个模型故意把小模板放在很低的局部深度，研究的是覆盖不足时产物如何分类。它没有模拟噪声、复杂重复和混样，不能直接回答实际群落里稀有成员的检出率。
Canu 2.2 使用高准确模式、相同的最短读长和最小重叠设置运行。设定的基因组大小是两条模板的长度之和。任务成功结束后，先保存阶段报告、主共识、未组装文件和片段布局表，再看是否出现目标序列。如果只交接主 FASTA，稀少模板的证据会整个退出后续检索。如果顺手把两份 FASTA 拼起来重新报总长度，又会把重复覆盖同一位置的三个片段当成互不重叠的区域。选择交付哪个文件取决于问题是准备注释主组装，还是寻找低覆盖目标的线索。Canu 快速上手与输入类型
三个片段怎样覆盖同一个短模板
主文件得到一条八万碱基的片段，标题记录用了四百二十条读段。比回长模板时八万个对齐列全部一致，布局表给出的覆盖值约为三十一点五九。短模板没有出现在主文件，却在未组装文件中产生三个条目。最长者为一万四千零四十五个碱基，标题标明五条读段。另两条各只有一条读段，各长六千七百零九和五千三百六十九。由此可以先做一次计数核对，五加一加一恰好对应给短模板设计的七条读段。但一个文件被称为未组装，并不意味着里面每一行序列都只由一条读段构成。
把三段都对回短模板，按零基左闭右开区间分别得到 1995 至 16040、0 至 6709、12631 至 18000。先按起点排序再合并区间，首尾相接覆盖从零到一万八千的全部位置。原始长度直接相加却是二万六千一百二十三，多出的八千一百二十三来自区间之间的重叠。即使每段在对应模板上的碱基都完全正确，也只能说已知模板上的每个位置在至少一个片段中找得到，并没有一条实际输出的序列独立覆盖全长。在没有真值的样本里，这个区别更重要，尤其不能根据某个近缘参考擅自填补两个片段之间的连接。
| 未组装文件里的片段 | 长度 | 读段数 | 短模板零基区间 |
|---|---|---|---|
| 中段 | 14045 bp | 5 | [1995, 16040) |
| 左端 | 6709 bp | 1 | [0, 6709) |
| 右端 | 5369 bp | 1 | [12631, 18000) |
实际制作统计表时最好单列片段覆盖模板的比例、模板被所有片段覆盖的比例及最长连续片段长度。第一项对每条输出计算，第二项先合并重叠，最后一项直接从单条序列读取。三个指标放在一行，就能解释为什么一个模板可以覆盖百分之百，同时仍缺少一条全长组装。
实跑经验｜同一份报告也可能有两种长度单位背景
canu -p mini -d asm genomeSize=98k useGrid=false maxThreads=4 maxMemory=8 minReadLength=1000 minOverlapLength=1000 -pacbio-hifi reads.fa
grep '^>' asm/mini.contigs.fasta asm/mini.unassembled.fasta
minimap2 -x asm5 -c --secondary=no ref.fa asm/mini.unassembled.fasta > short.paf
cut -f1,6,8,9,10,11 short.paf
阶段报告中还有一个值得单独核对的差异。主片段在构建完成、生成最终共识之前长五万九千八百七十九，共识之后长八万。未组装部分也由一万九千六百六十变为二万六千一百二十三，两轮的记录数却都相同。官方文档特别指出，高准确读段模式在共识之前以同聚物压缩后的序列空间报告统计。多个连续相同的字母可以临时表示成一个单位。拿早期阶段的数字直接和最终产物作差，再把差值解释成后续找回的基因区段，会混淆坐标空间。验收时要抄下阶段标题，并尽量从最终 FASTA 直接复算一次长度。Canu 对阶段统计与同聚物压缩的说明
我们也遇到了一个与生物学结果无关的早期退出。起初授权任务使用两线程，而这一版流程在检查配置时为校正任务请求四线程，输出明确指出没有可用的任务配置组合。改成四线程并给足本例内存预算，才开始得到实际组装结果。下一次见到程序刚启动就退出，先区分它停止在配置阶段，还是已经读到数据并生成了重叠文件。查输出目录、最后一个有数据的阶段和真正的首条报错，可以少做一次毫无必要的数据清理。Canu 参数说明
如果短模板代表样本中关心的低丰度区域，可以把未组装片段当作定位线索，回到原始读段检查两侧接头是否有多条独立分子跨过，并观察这里是否有近似拷贝可供误配。针对主组装完整性，只计通过标准纳入主输出的序列。针对目标有无证据，则同时交付匹配的原始片段、覆盖区间并集以及独立读段数。让同一个样本保留这两种统计，后续研究者既能继续查候选，也能判断目前的数据允许把结论说到哪一步。
当多个长读长样本需要统一保留布局文件、主组装和未组装证据时，可使用云生信的生物信息分析服务器复核各样本的结果。
