WhatsHap 实跑｜四个位点都是杂合，逐碱基深度也相同，为什么会分成两个相位块？

两个变异出现在同一条染色体拷贝上，和它们各在一条拷贝上，可能对应完全不同的后续验证实验。单看每个位点的杂合基因型，无法告诉我们是哪种组合。更容易被漏掉的是，分相后的文件里，即使每个位点都带竖线，也可能只有部分变异之间的位置关系得到读段支持。我们用完全相同的碱基和逐位置深度做了两份输入，只改变中间几条读段是不是同一条连续分子，再用 WhatsHap 实际分相。WhatsHap 官方使用指南

什么样的读段可以把两个位点连起来

若一条读段同时跨过两个可靠的杂合位点，能读出它在两个位置分别携带参考还是替代碱基，就能为两个等位之间的组合提供一份证据。还可以用多个重叠的连接间接延长范围。例如一组分子连接第一与第二个位点，另一组连接第二与第三个位点，交汇处的杂合位点就能传递相对关系。仅仅在基因组坐标上有重叠并不够，两批分子还要在适合区分两条拷贝的位置留下可读的碱基。大片纯合区域可以测得很深，却没有足够标记把它两侧的杂合组合接起来。

因此要先核对输入。变异表中的样本名要与比对文件读组的样本名一致，参考装配版本、染色体名和参考碱基也要一致。如果同一病例有不同时间点或相关个体，把这些读段误当成同一个人，算法会接收到相互矛盾的组合。正常流程应该先确认文件身份，再看哪些读段被纳入选取和重比对。跨样本混淆、局部错比对、低质量的杂合调用，都可能在断块或不一致的结果里留下痕迹。作者的读段分相方法与教程

实跑经验｜只剪开负责跨区的八条读段

我们造了一条三千碱基的参考序列，设置四个已知杂合位点，坐标从一开始计数，分别为 501、901、2101 和 2501。两条单倍型在每个位点各携带一个等位。左侧读段覆盖前两个位置，右侧读段覆盖后两个位置，另有八条中间读段同时经过两个内侧位置。第一组保留完整分子。第二组把这八条各剪成两段，左右片段使用不同读段名，仍在原来的位置比对，没有删掉或增加任何一个碱基。运行版本为 WhatsHap 2.8，使用同一个参考文件和未分相变异表。

我们还用程序逐个比较参考上三千个位置的深度，全部一致。完整组的四个位置共享同一个相位组编号，剪开组的后两个位置获得了另一个编号。原因可以直接在比对里找到，中间的两个位置仍各有九条参考支持和九条替代支持，但剪开后没有一条分子同时为两个位置作证。由此可见，即使“分相比例”一栏两边都写百分之百，它也无法替代“关心的两个变异是否同块”这个问题。

读懂竖线旁边的相位组编号

在完整组，前两个位点依次为 1|0 和 0|1。在剪开组，这两个位置的写法一起翻转成 0|1 和 1|0。乍看像是结论反过来了，其实它们内部仍然是相对的，两处替代等位仍位于不同拷贝。只凭单个个体的读段，算法通常无法给输出的第一列命名为父源或母源。同一块中所有位点的两列一起交换，仍表达相同的相对组合。真正需要担心的是只翻转某一段，改变了同一块内部有证据的相邻关系。

换到不同相位块，块的左右方向可以各自独立翻转。剪开组的第一和第四个位点恰好也填写了两列数字，但这时比较两行的第一列已经越过证据边界。在真实项目里给出顺式或反式判断时，应同时报告样本、染色体、相位组编号、目标坐标和支持的读段。如果两个目标跨块，只能记录为这批读段未确定相对关系。可以再找更长的分子、家系信息或其他独立证据，而不能用文本列的排列延长证据范围。

whatshap phase --reference ref.fa -o phased.vcf input.vcf example.bam
whatshap stats --block-list blocks.tsv --tsv stats.tsv phased.vcf
bcftools query -s S -f '%CHROM\t%POS[\t%GT\t%PS]\n' phased.vcf

在自己的位点上怎样排查

先把感兴趣的两个位置从输出文件中逐个取出，核对它们是同一样本、同一染色体上的杂合调用，然后比对相位组字段。遇到中途断块，可以从最后一个有连接证据的杂合位点向外看，记录跨过它和下一个合格位点的分子数。检查这些分子是否在两个位点都具备足够碱基质量，是否在重复区有多处相似比对，是否只是在坐标上横跨却用删除操作跳过了关键碱基。把能读出两端组合的分子列出来，比把某个位置的总深度记得更精确。

如果项目最终要比较两个方案，除了每个位点的分相比例，还应报告每个相位块包含多少个杂合位点、从哪个坐标延伸到哪里，以及目标基因中有多少对位点落在同一块。相位块跨度很大时，中间可能有很长一段没有信息的序列，两个端点之间也未必由一条单独分子直接跨越。要检验分相是否正确，还需要可信真值或独立材料，按各块相对方向可交换的原则计算切换错误。以上这次人工对照验证的是连续分子对成块的作用，适合用来检查统计口径。WhatsHap 相位块统计与比较

下载本篇实验脚本与结果（12 篇合集 ZIP），解压后打开 079-whatshap 目录。

需要对一批长读长样本反复核对目标位点及其跨越读段时，可以在云生信的生物信息分析服务器把比对、参考和分相版本保存在同一分析目录。