把长短相差一千四百碱基的两个单倍型放进泛基因组图，差异看起来很简单。当短序列作为参考，额外序列是某个位置上的插入。换成长序列作为参考，没有这段序列的样本便跨过一段参考区间。用同一对输入实际建两次图，可以看到坐标、节点来源和样本路径如何一起变化。还有一个值得保留的结果，第二张图正确容纳了两种结构，但这次逐样本回查没有给出穿过气泡的确定路径。minigraph 作者的构图与调用说明
先分清三个不同的坐标
一个图节点有自己的编号、内部序列和长度。rGFA 还为该节点保留一套稳定坐标，包括它来源于哪条序列、在这条序列中的起始偏移，以及在构图中所在的层级。第一份作为骨架的参考对应零层，后面加入的序列可以为图贡献新的片段。样本组装与图重新做比对时，还会出现第三套位置，即样本自身的坐标。同一个数字可能分别是骨架断点、原始序列上的偏移或查询样本的对齐边界，抄写到结果表前应加上对应序列名。rGFA 格式及稳定坐标定义
构图输入也有讲究。作者的增量建图流程把每一份后续文件看作一个个体的组装，试图找出适合加入图的对应区域。把很多个体的组装随意拼在同一个文件里，会改变同一区域出现多少次，进而影响对应判断。做工具试验时最好用独立文件保留每份样本的身份，记录输入顺序和初始骨架。从图中看到第一份以外的样本名，不代表该样本的每个碱基都新建了一个节点，共享部分通常可以沿已有节点行走。
实跑经验｜先用短骨架，再把两份输入对调
两条人工序列共享四万五千碱基的左翼和四万七千碱基的右翼。短序列长九万二千碱基，长序列在左右翼之间多出一段固定随机种子生成的一千四百碱基。我们从源码编译 minigraph 0.21。第一次直接用构图预设，短骨架输出只有一个九万二千碱基的节点，没有得到预设差异。查看这个版本的帮助，默认最小比对长度是十万，已经超过这条试验序列。按作者小数据示例把这个值降为一万后，两种输入顺序都构出了带分支的图。这个修正是为了让小对照运行，真实组装应单独评估放宽阈值会带入哪些重复匹配。minigraph 参数手册
| 检查项 | 短序列作为骨架 | 长序列作为骨架 |
|---|---|---|
| 额外 1400 bp 的节点来源 | long，起点 45000，层级 1 | long，起点 45000，层级 0 |
| 气泡在骨架上的区间 | short 的 [45000,45000) | long 的 [45000,46400) |
| 对两份样本分别运行调用 | 短样本走长度为 0 的支路，长样本经过 1400 bp 节点 | 两份样本的路径栏均为一个点 |
短骨架上的区间起止相同，因为替代路径在两个相邻骨架片段之间多走一段，插入本身不消耗短骨架碱基。把两份输入对调，原来的额外片段成了骨架的一部分。现在短样本可以通过图中的直连边跳过它，长骨架上被跨过去的区间长一千四百。两张图里的那段序列均逐字等于我们预先加进去的碱基，来源名都是长样本，但层级一个为一，一个为零。交换参考后，如果还用旧文件中一段区间的长度去筛新表，就会把同一份结构差异拆成两套统计口径。
人手能做一个很快的核对。把短骨架两侧节点首尾相接，应恢复原来的短序列，再把额外节点按边的方向插在中间，应恢复长序列。换成长骨架时，一条链的三段首尾相接可以还原长序列，沿跳过中段的那条边则还原短序列。这个检查只回答图中能否拼出两种序列，接下来样本如何被分配到路径上，还要另读逐样本分型输出。
星号和点承担不同的信息
短骨架的两条样本结果都有完整的路径栏。短样本的路径以星号表示气泡内部没有额外节点，紧邻的长度字段明确为零。长样本对应的是额外节点的名字和长度一千四百。长骨架结果却是两行各只有一个点，没有带出样本的内部路径和长度。打开普通图比对后，短查询分成两段，长查询分成三段，各段的映射质量都是六十，但都没有以一条记录连接气泡两侧。局部能高质量比到某个片段，与能够跨过两侧锚点确定走了哪条等位路径，是两个可以分别检查的条件。
这里不必根据真值替程序补写答案。我们知道长样本包含那段序列，是因为手里有它的完整 FASTA。若交付的是这个版本的调用表，就应把没有路径的两行保留为未判定，另列通过序列直接核实的结果。在没有人工真值的材料中，这种区别更重要。把点当作零长度等位会把查不清的样本算进缺失组，后续估计携带比例或与表型做比较都会受影响。要解决歧义，可以查看查询端的分段范围、气泡两侧的图连接和更长的序列锚点，再决定能否作出补充分型。
minigraph -cxggs -l10k -t2 short.fa long.fa > short-first.gfa
minigraph -cxggs -l10k -t2 long.fa short.fa > long-first.gfa
minigraph -cxasm -l10k --call short-first.gfa long.fa > long.calls.bed
minigraph -cxasm -l10k long-first.gfa long.fa > long.alignments.gaf
真实项目比较两次构图时，先取同一条样本序列分别走两张图，记录稳定坐标、穿越方向、两个边界和内部序列。用两侧锚定序列和内部序列身份来匹配差异，再统计坐标表达、样本判定以及缺失率是否变化。小图的节点名字可以直接查看，换一个构图顺序后它们往往会重新编号。保存初始骨架、后续文件顺序和构图参数，下游才有机会重现同一张图，再检查某个气泡的生物学解释。
下载本篇实验脚本与结果（12 篇合集 ZIP），解压后打开 082-minigraph 目录。
多套组装需要在不同骨架上交叉验证时，可以在云生信的生物信息分析服务器保留原始组装、两版图和各自的回查文件。
