HISAT2 实跑教程｜比对率都是 100%，为什么剪接结果却不一样

RNA 测序完成比对之后，很多人首先查看总体比对率。这个数字有助于发现严重的参考不匹配或数据问题，但它不能告诉我们每条读段是否按照预期的外显子结构完成比对。读段的一部分可以被软剪切，剩下的部分仍然成功匹配，因此“比对成功”和“剪接连接被正确表示”是两个需要分别检查的问题。

本文实际安装 HISAT2 2.2.3，设计一个只有两个外显子的人工位点，用六条没有测序错误的读段做四组对照。未提供注释与提供已知剪接位点时，总体比对率都是百分之百，但其中两条读段的比对结构发生了明显变化。这个实验适合用于学习结果阅读，不用于估计真实样本中的检出率。

一、先明确 HISAT2 在回答什么问题

HISAT2 将读段定位到参考序列，可以处理跨越剪接位置的比对，并输出后续工具能够读取的 SAM。对于普通短读长转录组，参考通常是基因组，成熟转录本中的相邻碱基在基因组上可能隔着很长的内含子。这与直接将读段匹配到转录本序列的任务不同。作者手册

因此，评价一次比对至少需要同时看定位位置、比对结构和未被解释的碱基。只看定位是否存在，会把完整跨越连接的读段和仅保留一段的读段放在同一个“成功”类别中。若接下来要统计剪接事件，这种差异会直接影响支持连接的证据量。

这个工具的优势是能够将基因组定位与剪接信息放在同一结果中，便于继续检查覆盖和连接。局限是结果依赖参考、候选剪接位置、读段本身的信息量与所用参数。提供一份注释有时能帮助解释短锚定读段，但注释本身仍需要正确匹配当前参考。

二、把实验设计到能够逐条解释

本次人工参考长三千碱基，只有一个名为 chrToy 的序列。第一段外显子位于五百零一至一千，第二段位于两千零一至两千五百，中间为一千碱基内含子。外显子及背景按固定随机种子生成，内含子两端设置为正链常见的 GT 和 AG。

六条输入均为一百五十碱基，质量字符一致。除了普通外显子读段和跨越外显子与内含子边界的连续基因组读段，还有四条跨越外显子连接的读段。四条连接读段在左外显子上分别具有七十五、十二、八、四个碱基，其余部分来自右外显子。

这些读段不是实际测序样本，没有引入测序错误，也没有模拟复杂重复区域。这样做的目的是减少其他因素，让读者能把变化追溯到剪接先验和软剪切。实验过于简单，不能据此宣称某组参数在真实转录组里具有同样表现。

读者还应注意，短锚定本身不等于低质量。这里所有碱基质量都相同，区别来自能够支撑连接一侧的序列长度。真实数据中，质量差、同源区域、重复结构与短锚定可能同时存在，需要分开判断。

三、已知剪接位点怎样准备，坐标怎样核对

我们先写出两行 GTF 外显子记录，再实际调用安装包中的提取脚本。输出为 chrToy、999、2000、正链标记。这两个数字不是将内含子的首尾位置原样复制过去。最稳妥的方法是让配套脚本从同版本注释提取，再用一个可手工检查的位点验证。

hisat2_extract_splice_sites.py genes.gtf > sites.tsv
hisat2-build -p 2 genome.fna idx

hisat2 -p 2 --no-temp-splicesite \
  -x idx -U reads.fq \
  --known-splicesite-infile sites.tsv \
  -S known.sam

在本例中，GTF 使用的一起始闭区间外显子坐标是 501–1000 与 2001–2500。提取文件记录的是对应边界的零起始坐标，得到 999 与 2000。它们与 SAM 中的一起始定位字段、以及内含子的区间表示各有用途，不应混着加减一。

实际项目里，最常见的准备错误并不一定是命令拼错，而是染色体名称或参考版本不一致。同一个位置编号放到另一套组装上未必表示同一序列，带前缀与不带前缀的名称也可能无法对应。检查时可先比较名称集合，再抽查几个外显子的参考序列和连接位置。

本次所有组都额外关闭了运行过程中临时剪接位点的共享，目的是隔离“给定注释”的作用，减少读段处理顺序对这个小实验的影响。这是实验控制条件，不是建议所有正式项目都照搬该选项。理解一个对照需要知道哪些变量被固定，不能把控制条件自动当作最佳实践。

四、四组实际结果，不能只比较成功比例

四组依次为不提供已知剪接位点、提供已知位点、提供位点并禁止软剪切、关闭剪接比对。前三组全部六条成功定位，最后一组为五条成功定位。若只读总体比例，前面三组看起来完全一样。

不提供位点时，四条真正跨越连接的设计读段中只有两条被表示成剪接比对。提供位点后，四条都出现了与设计结构一致的跳跃。禁止软剪切的已知位点组在本次输入上与普通已知位点组一致，没有增加新的成功记录。

这说明总体比对率没有覆盖我们真正关心的差别。对于连接分析，更直接的核验是逐条检查哪些读段含有跨内含子的结构，跳跃长度是否正确，左右支持分别多长。成功定位只完成了其中一部分检查。

关闭剪接比对后，七十五比七十五的连接读段无法以本次条件完成连续匹配，但三条短锚定读段仍然被保留为软剪切结果。不能因为它们仍在 SAM 中且显示成功，就认为关闭剪接不会影响该区域的分析。

五、把 CIGAR 当作解释结果的主线

在本次结果中，M 描述参加比对的读段碱基，N 描述参考上的跳跃，S 描述保留在读段序列中但未参加当前比对的软剪切部分。M 本身不保证所有碱基都完全一致，还应结合差异标签检查。SAM 格式规范

以 8M1000N142M 为例，左右参加比对的读段长度加起来是一百五十，中间跳过一千个参考碱基。内含子长度消耗的是参考坐标，不额外消耗读段长度。若把这一千也算到读段长度里，就会得到明显错误的覆盖或连接长度。

再看 7S143M。它并不代表程序忘记输入原本有八个碱基来自左外显子。当前连续匹配还可以利用边界附近一个恰好相同的碱基，所以最终软剪切长度与设计中的左侧锚定长度相差一。实际起始位置为两千，包含内含子末端的那个碱基。读者需要同时核对序列和坐标，不能仅凭软剪切长度反推真实剪接结构。

四碱基锚定读段也有同类现象，实际为 3S147M。这个小例子提醒我们，比对算法会寻找符合评分的解释，而不是读取实验者心中预设的来源标签。存在一个可接受的连续解释时，正确的生物学来源不会自动写进结果。

因此，若看到很多末端软剪切，应先判断它们是否集中在连接附近、是否受到注释影响、是否同时出现在重复区或低质量区。不要看到一个软剪切就直接命名为新剪接、融合或结构变异，也不要在没有看序列的情况下全部丢掉。

六、MAPQ 很高，为什么仍然需要看结构

本次成功定位的读段 MAPQ 都为六十，包括那些短锚定读段的软剪切结果。这个现象很有教学价值，因为它直接说明一个较高的定位质量数字并不等价于“整条读段已经按预期的转录结构解释”。

定位质量、比对评分、碱基差异和剪接结构描述的是不同方面。将它们压成单一通过条件会丢失信息。对于一个重点连接，可以同时记录定位是否唯一、左右锚定长度、是否存在软剪切、跳跃是否对应注释，以及支持来自多少独立片段。

这里也不应反过来声称高 MAPQ 没用。它仍然是结果审阅的一部分，只是需要放在所回答的问题中。若目标是检查定位歧义，它与目标相关。若目标是证实某个外显子连接，则需要额外检查连接本身的证据。

实际统计 SAM 时，应按标记识别未比对和次级记录，不能仅用文件行数作为读段数量。本次每个输入只有一个对应记录，复杂样本可能为同一读段提供多个记录。分母一旦从独立读段变成记录行数，比例解释就会改变。

七、基因组连续匹配也不能直接证明污染

本次名为 unspliced_DNA 的对照来自外显子与内含子的连续基因组序列，在四组中都是 150M。这个名字描述我们怎样生成输入，并不是工具根据序列自动给出的样本诊断。软件只完成了连续定位，没有证明真实样本存在某一种污染。

在真实 RNA 数据里，内含子相关信号可能与实验方案、未成熟转录本、内含子保留、基因组 DNA 残留或其他因素有关。应结合文库制备、全局分布、独立验证与注释背景分析，不能把本次人为命名直接推广成判定规则。

同理，SAM 中的正反向标记与转录本链信息也需要分别理解。一个描述读段如何相对参考定位，另一个需要结合剪接和文库约定解释。链特异性设置应来自实验方案并经过数据核验，不能凭某一个连接的方向推断整批样本。

本文没有实测不同链特异性参数，也没有评估反义转录本，因此不把这部分延伸讨论写成已有实验结论。给出结果的适用范围，才能避免一个小型演示在传播中逐渐变成没有证据的普遍规则。

八、从安装到结果，怎样保留可复核记录

实际环境固定为 HISAT2 2.2.3 的容器镜像摘要，脚本保存参考序列校验值、随机种子、GTF、提取后的位点文件、所有读段和四组解析结果。普通比对日志与 SAM 记录一起保留，读者能够从摘要回到具体读段。

本次版本命令输出中还包含构建时的编译器信息，其中有一段链接器错误文字，但建立索引和四组比对实际均以零退出码完成。遇到这种情况，应区分版本元数据与当前命令执行日志，不能仅凭版本文本中的一个词就宣布本次安装失败。

处理自己的样本时，可先选择少量具有代表性的区域做同类对照。固定输入和索引，只改变一个与问题有关的选项，观察具体记录怎样变化。若一开始同时更换参考、注释、软剪切和链特异性设置，即使结果改善，也难以判断是哪一项造成变化。

最后形成报告时，建议把总体比对率与任务相关的证据分开呈现。研究基因表达可以关注分配到注释区域的读段及其规则，研究剪接则需要关注连接支持与边界，研究异常结构还需要更严格的证据核验。指标应服务于问题，而不是只追求一个更高的比例。

下载本组复现材料可以获得固定环境信息、输入生成脚本和四组完整结果。关于所用版本，可查阅HISAT2 发布记录。

当这类参考、注释和参数核验需要扩展到多批次 RNA 数据，并保留可追溯的分析记录时，可以了解云生信生物信息分析环境服务。