CellChat 少了一条配体–受体连线，去哪里找原因？

一张治疗前后的细胞通信图上，成纤维细胞指向免疫细胞的一条线消失了。同事想知道是不是治疗阻断了这条通路。打开两组对象，可能发现治疗后根本没采到足够多的接收细胞，也可能发现配体明明还有人表达，只是表达细胞过少，按组汇总后变成了零。这几种情况在圆圈图上看起来一样，却需要完全不同的后续实验。追查一条线时，把发送群、接收群、具体配体和受体同时固定下来，能省掉许多来回试参数的时间。

先给一条边找到四个名字

设想要追查的是成纤维细胞中的配体和某一类免疫细胞上的受体。第一步先列出两组的细胞类型标签和每位供体各有多少细胞。如果治疗前把免疫细胞细分成四群，治疗后却只保留一个大类，那么即使同一个小群的表达没有变化，合并入更多不表达受体的细胞也会改变平均值。最好明确两个数据集共有的注释层级，保留原始细分标签，再在同一套定义下比较。

第二步检查数据库记录。一个配体–受体对有时需要多个亚基共同构成受体，也有相互作用受到协同因子等项目影响。只在图上找到了其中一个显眼的受体基因，不足以说明这个复合物在接收群中有充分表达。把物种、数据库版本、配体和各个必要亚基逐项列出，再去看这些基因的检出分布。若原始矩阵的编号无法对应数据库，先处理名称和物种匹配。CellChat 作者的分析教程

一样的普通均值，为什么软件可能只画出一条线

用两个各有二十枚发送细胞的教学样本演算。甲组四枚细胞每枚表达五个单位，其余十六枚为零。乙组十枚每枚表达两个单位，其余十枚为零。两组普通均值都是一，表达细胞比例却分别为五分之一和二分之一。如果只报告合并均值，读者看不到是哪种格局支撑了信号。

三均值用第一四分位数、两倍中位数和第三四分位数相加，再除以四。甲组这三个位置都在零值区。乙组则分别是零、一和二，放入公式为一。这个例子只取出组表达汇总这一步，软件完整的通信概率还用到接收端表达、数据库关系和设置等条件，不能把表中最后一行理解成最终绘线的通信概率。它解释的是，恰好在少数细胞表达的配体，即使阳性细胞的分子量很可观，也有可能在相对稳健的汇总中消失。CellChat 模型与组内表达计算

可以用下面的短脚本核对这组具体数值。拿到真实数据时，也可把同一配体在每位供体内的普通均值、稳健均值和检出比例放在一张表里。如果某条边只在换成较宽松的截尾均值后出现，把两种结果同时展示，并回看是否只由几个细胞贡献，比挑出有线的那张图更有解释力。

a <- c(rep(0, 16), rep(5, 4))
b <- c(rep(0, 10), rep(2, 10))
trimean <- function(x) {
  q <- quantile(x, c(.25, .5, .75), names = FALSE)
  sum(q * c(1, 2, 1)) / 4
}
rbind(A = c(mean(a), trimean(a)), B = c(mean(b), trimean(b)))

分开检查丰度、筛选和转录本表达

若启用了按细胞群大小考虑总体信号的设置，同一群细胞的采样比例也会参与计算。通过分选有意富集了免疫细胞的样本，其上机比例已经偏离原组织的构成。用同一套细胞把考虑群体大小的设置分别开关，可以判断网络变化是否依赖这个假定。两次比较应固定其他参数，也要保存每位供体的细胞数。多数细胞来自一份组织时，合并后算一次无法告诉你这条线是否在多位供体中都出现。

有时问题发生在绘图之前。先打开配体–受体级别的结果表，查发送端和接收端方向是否写反，再看这对细胞群是否被最小细胞数筛掉。下一步核对通路层的汇总是否把好几组分子关系合成一项。即使通路总权重更大，也可能是一条新入选的配体对贡献了多数变化。对应到单独边时应报告究竟是哪对分子、哪一端的表达和多少供体支持这项差异。

还有一种很容易忽略的假阳性来自合并供体。设甲供体的发送细胞有很强的配体表达，却没有检测到可靠的受体阳性接收群。乙供体恰好相反，接收端表达很强，发送端却基本没有配体。把所有细胞合并，发送平均和接收平均都可能达到可观数值，它们却来自不同的人，没有机会发生这次组织内通信。对值得做实验的分子对，可为每位供体并排列出两端的检出细胞数、总细胞数和阳性细胞表达，并标出两端是否有共同支持。若只有合并后才出现这条线，下一步应优先寻找同一组织中两端同时存在的证据，而非直接把它作为该组普遍增强的通信。

给后续实验留下可以证伪的问题

如果一对细胞群的推断边重复出现在多个独立样本里，下一步仍取决于信号类型。对于需要直接接触的关系，可先在组织切片上查看两种细胞是否相邻，并检查受体蛋白定位。对于可溶性配体，空间接近可以提供线索，还可进一步测分泌、接收细胞的下游应答或阻断实验的变化。把预测和可检验的条件对应起来，能避免把图上的线条粗细直接解释为真实分子流量。

与合作者交流时，给出具体的发送与接收群、候选分子对、检出比例、依赖的汇总方法，以及在什么额外证据下可以增强或推翻判断。若一种解释在两套合理的细胞注释下消失，也应写进图注。后续若要让团队共享相同的数据库版本和多供体对照环境，可了解云生信的生物信息分析服务器。