一张按供体着色的图，整合前分成两团，整合后蓝点和橙点混在一起。用这两张图向合作者汇报时，一个合理的追问是，那两团原来是否代表同一种细胞？如果一团主要是淋巴细胞，另一团主要是上皮细胞，让它们混合并非这次分析要得到的结果。Harmony 校正的是降维空间中的表示。要判断这次校正是否合理，最好提前挑出应该相互接近的细胞，也指明哪些状态理应继续分开。
把批次、供体和处理条件交叉列出来
先做一个细胞数交叉表，行是供体，列是建库或上机批次，并在旁边标出实验处理。如果一个供体跨两个批次测序，这是观察技术差异很好的内部对照。若所有对照供体只在第一批，所有处理供体只在第二批，技术和处理就没有机会在数据中独立变化。看到按批次着色分开，无法从这张图直接判断应当去掉的偏移究竟有多少。此时一味增大校正力度，可能把真正的处理响应一同压平。
再给每个主要细胞类型统计各批次的细胞数。一个批次中没有观察到某种稀有群体，它就缺少可在另一批直接对照的同类细胞。先把这些单批次群体圈出来，后面核查时应看它们是否保留了可靠的标记和组织定位，而不是给它们硬订一个“必须和另一种颜色混合”的指标。一个样本中含有某个群体和这个群体在该样本中占比高，也是两个需要分别记录的事实。
分清校正坐标与原始表达
典型 Seurat 流程从已有主成分出发，把需要考虑的批次字段传给 Harmony，然后将得到的低维表示用于建邻居图。输入矩阵是基因表达，主成分是若干综合方向，Harmony 返回的是经过调整的细胞坐标。一个细胞在校正坐标上发生移动，不代表其某个基因被扣掉了几个分子。核实谱系、做供体内表达检查时，应回到与问题匹配的表达层。Harmony 的方法说明 · RunHarmony 参数及返回值
下面假定对象已完成归一化和主成分分析，另有已确认的批次列，主成分数至少为二十。把用于绘图的各版本分别命名，能避免两次展示时误用同一个默认降维。如果提前做过整合，请先确认当前主成分是从哪套特征或表达层算来的，避免把已经校正过的表示当作未经处理的基线。
library(Seurat)
library(harmony)
obj <- RunHarmony(obj, group.by.vars = "batch")
obj <- RunUMAP(obj, reduction = "pca", dims = 1:20,
reduction.name = "umap.pca")
obj <- RunUMAP(obj, reduction = "harmony", dims = 1:20,
reduction.name = "umap.harmony")
给一张混色图配上两个反例
设在一个教学样本中，甲、乙两批各有五十个初始淋巴细胞，两批又各有五十个效应细胞。第一次看图时先在初始细胞内部比较，第二次只看效应细胞。若校正后两个类型各自都混合，同时类型之间仍按整组标记分开，这个现象与预期一致。若把两类细胞合起来看，哪怕初始细胞集中在甲、效应细胞集中在乙，只要在投影边缘挤在同一片，也可能看起来“颜色混得不错”。
| 先固定的对象 | 想保留的现象 | 出现什么情况需要重查 |
|---|---|---|
| 两批均有的同一细胞类型 | 供体间相似细胞能成为邻居 | 同一供体始终独占大部分近邻 |
| 生物学标记清楚的两个状态 | 状态标记仍在对应细胞共同出现 | 校正后彼此充当近邻，原始标记却稳定分离 |
| 只在一批观测到的稀有群 | 对其独有状态保留解释空间 | 被并入不同谱系，只剩批次混合指标变好 |
另一个反例与组分有关。假设某类细胞在甲占九十个、乙占十个。一个甲细胞附近十个同类里只有一个乙，仍可能恰好符合这个群体的来源构成。请先在细胞类型层面计算基线，再汇总多个细胞的近邻组成，最好还能按供体汇总。不要从图中央挑一个看起来最均匀的局部替整套数据作结论。尤其需要检测罕见状态是否还能被找到时，宁可把这群细胞单独列出来，也不要让大群体的平均表现把它们淹没。
参数也容易调反。固定其他设置时，增大多样性惩罚 theta 会更鼓励同一软聚类内出现不同批次。岭回归惩罚 lambda 用在估计校正项的步骤，在手动给定正值时，较小的惩罚通常允许更强的校正。两者作用在不同环节。一次同时提高两个数，即使图像变化也很难解释是哪项操作造成。可以先挑一组跨批技术重复，固定岭惩罚只改变多样性要求，再固定多样性要求只比较岭惩罚。为每次计算另存校正坐标，同时记录最容易受影响的那个稀有群有多少细胞仍与相同谱系互为近邻。
实跑经验｜同一千六百条邻居关系要查两遍
我们在 Ubuntu 的 R 4.3.3 中安装 Harmony 2.0.5，做了一个已知真实分组的对照。模拟一百六十个细胞，两种生物状态、两个批次，每一个状态和批次的组合各有四十个细胞。六维输入的第一维主要承载状态差异，第二维主要承载批次位移，其余维度加入随机扰动。固定种子三十七，只让 Harmony 使用批次列，状态列留到评估时才打开。每个细胞在原坐标和校正坐标中各找十个近邻，排除自己，两次分母均是一千六百条有向关系。
校正前，跨批次的邻居只有三条，校正后增至六百七十二条。再用同一套邻居编号核对状态，校正前后各有一千六百条同状态关系。这个教学设计中，算法改善了同类细胞的跨批接近程度，保留了人为放在第一维的清晰分组。能得到这样的对照，是因为每个组合都真有细胞，且状态标签独立于校正输入。真实数据若有某个处理组仅来自单一批次，就不能期待通过同一套数值区分两者。安装时还遇到了可重复定位的问题，系统有编译器却缺少 BLAS、LAPACK 和 Fortran 链接库，安装相应开发包后才顺利加载。处理类似报错应先看链接器列出的库名，调整生物学参数解决不了安装失败。
从一次校正估计，到可以复核的结论
可以固定细胞和基因集合、主成分数、邻居设置以及可视化方式，只改一个会影响 Harmony 校正强度的参数。比如围绕多样性惩罚参数比较几个设置，记录每个设置下共同细胞类型的跨批近邻比例、已知状态间的混淆，以及多个独立供体的结果是否一致。参数本身没有脱离数据仍最优的数值。观察到更强的混合后，还要检查能否通过更换合理参数得到同样的生物解释。若结论仅在某个极端设置下成立，应当将这一敏感性写进报告。
在确定是否过度校正时，还可以把最值得怀疑的群体沿原始坐标和校正坐标分别高亮，邻居连线所用的表示也写清。查看几条事先选好的谱系标记，而非在结果里事后找最配合图形变化的基因。若同一状态在多个供体中都保持一致标记，却只有校正图把它混进另一群，优先保留两种解释并寻求独立证据。若变化只来自某个低质量供体，应回看该样本的测序深度、线粒体比例和实验处理，不能期望降维校正替代样本质量检查。
最终交给合作者的图注应说明校正字段、输入主成分、后续建图使用哪个表示，以及表达图来自哪套原始或归一化数据。若需要对处理条件做差异表达检验，应按独立样本设计分析，不能把 Harmony 坐标本身当作基因计数。等一份图谱的核查方式稳定后，团队常需要共用既有对象，同时重跑参数对照。需要这样的共享环境时，可了解云生信的生物信息分析服务器。
