PASTE 对齐两张切片，为什么已经裁掉的区域仍然有匹配？

两张相邻切片并排摆在屏幕上，左图有一小块组织伸出，右图在相应位置恰好裁掉了一角。运行对齐程序后，左图这块组织仍向右图发出几条连线。它是否在另一张片上还有对应的细胞群？要回答这个问题，先看输出矩阵在数学上必须满足的条件。原始 PASTE 的两片对齐输出描述两张切片的点位质量怎样分配。若每个点都必须把分配额度用完，即使另一片缺了一角，也依然能得到某种分配。这会直接影响如何阅读彩色连线、最大匹配和叠合图。PASTE 原始方法

给传输矩阵写上行名、列名和分母

设矩阵的行是来源切片上的捕获点，列是目标切片上的捕获点。软件结合两种信息估计矩阵，一种是跨片表达特征差异，另一种是各片内部的点间几何关系。使用同片相对距离有一个具体好处，一张片即使整体旋转和平移，内部任意两点间的距离仍然保持不变。若一张片的坐标单位是像素，另一张是微米，或者经历了不均匀的形变，几何关系就未必能直接比较。实际对齐时应保留坐标单位和原始照片，并先确认两张片取的是同一解剖层面的足够重叠区域。

在默认均匀边际的例子里，若来源有六个点，每行应加到六分之一。目标若有五个点，每列应加到五分之一。值为零点一六七的格子可能已经耗尽了这一行的全部额度，不能看到它小于一点零就解释为只有不足两成把握。若要描述某个源点流向各目标点的相对占比，先将该行除以它的和。这个占比受给定表达、几何和边际约束共同影响，不能直接当作生物同源概率。对照两个分母，是读这种表格最省时间的一步。作者包的配对接口和边际参数

实跑经验｜删除一个真实对应点，矩阵把这一行放到了哪里

我们安装 paste-bio 1.4.0，用六个非完全对称排列的点和十二个基因构造模拟切片。每个点拥有一对相对突出的表达特征。复制切片时，保持表达向量不变，将坐标旋转九十度并平移，再故意打乱目标点的存储顺序。两片的所有点名在试验记录中都有已知对应，因而既能考察旋转平移，也能检验脚本有没有偷用相同行号。使用均匀边际、欧氏表达差异，空间项权重设为零点一，并启用空间距离归一化。完整情况下，六个源点的最大质量都对应到正确目标，每行只有一个约六分之一的非零项。

第二次仅从目标片删除源编号五的副本，其他五对仍然一一对应。重新运行后，这五对的最大匹配全部正确，但源编号五的那一行向五个目标各分配约零点零三三三三，总和仍为六分之一。换算成这一行内部的比例，每个目标约占五分之一。若脚本只导出一列最大位置，它依然会给出某个具体编号，却会隐藏这个源点对五个位置几乎等量分配的事实。这个例子可以手算核对。每个目标须收到五分之一，已有的同源点贡献六分之一，余下的三十分之一正好由缺少对应的源点补齐。

import numpy as np

# pi 来自一次 pairwise_align，行、列次序分别来自当时的两个输入对象
row_sum = pi.sum(axis=1, keepdims=True)
share = np.divide(pi, row_sum, out=np.zeros_like(pi), where=row_sum > 0)
ranked = np.sort(share, axis=1)
print(pi.sum(axis=0), row_sum.ravel())
print(ranked[:, -1], ranked[:, -1] - ranked[:, -2])

版本也是复现的一部分。我们的首次尝试配套较新的 POT 0.9.7.post1，优化器给线搜索回调传递的参数数量与这个 PASTE 版本不一致，计算中途抛出异常。固定 POT 0.9.4 后，同样输入完成了上述两次对齐。判断是否成功应同时检查返回矩阵、行列边际和已知阳性对应。仅能导入包，或者只获得一张坐标叠合图，无法验证读取的矩阵究竟对应哪两个输入对象。

另一个能从这组数据直接演练的检查是调换观察方向。将目标片作为行读取时，先转置矩阵并使用新的行和归一化。裁剪后的目标片有五枚点，每枚点收到的五分之一里，同源点贡献六分之一，缺失点贡献三十分之一，因而反向条件份额分别为六分之五和六分之一。正向看缺失点是对五处各给五分之一，反向看任意目标都有一个主要来源，两个结论并无矛盾。给叠合图加箭头或做标签转移时，注明从哪张切片向哪张转移，以及先按行还是按列归一化，能排除这种方向误解。

用留出的区域验证对齐，而不是只检查最亮的一条线

对真实切片，建议先用同一组织内明显可辨认的两三个结构作地标，再单独圈出疑似缺损、折叠或边缘裁剪的区域。将前一组地标用作可核查的正对照，后一组则专看是否被分配到多个不相邻候选。若几何与表达都将一个点映往解剖上合理的邻近区域，而且独立标记也支持这种关系，写成局部对齐具有依据。若整行非常分散，或者几个几乎并列的候选落在不同组织层，就应保留这种不确定性。改变目标表的行顺序再运行一次，也是捕捉编号误用和并列最大值的简单测试。

当两张片只有部分重叠，可以先讨论明确的共同组织区域，必要时比较能显式处理部分重叠的方法。PASTE2 是作者另行提出的部分对齐方法，适用问题与这里实跑的原始平衡传输不同。即便采用了部分对齐，还要核查选取的重叠比例与病理轮廓是否相容。能拒绝某些分配只改变了模型允许什么，独立地标、区域级误差记录以及输入条形码追踪仍是判断结果好坏的依据。部分对齐的原始研究

将上述核查扩展到连续切片时，保留每对输入的顺序、原始坐标、传输矩阵和逐行份额，便于追查某一步发生的漂移。需要批量对齐并保留这些中间结果的团队，可了解云生信的生物信息分析服务器。