骨髓样本里出现一小群细胞，同时带有两套平时分开的谱系标记。异常高的分子数、夹在两群之间的位置和双细胞高分，都让人怀疑是两枚细胞进入了同一个液滴。偏偏真正的分化过渡状态也可能具备其中几项特征。拿到 scDblFinder 结果后，最值得问的不是删多少个才合格，而是这些细胞能否由同一捕获中真实存在的两类细胞组合解释，以及这一判断如何影响下游结果。
把“样本”换成实验台上真正发生的捕获
一个液滴中的两枚细胞必须在装载时有机会彼此相遇。甲供体和乙供体各自上不同的通道，事后才将矩阵合并，两个人的细胞之间不可能在这两次实验里形成同一液滴。相反，两位供体在上机前已经混合并进入同一个捕获通道，跨供体双细胞就成为物理上可能的组合。因此用于拆分运行的字段应追溯到捕获过程。患者、时间点、样本、上机批这一串词不能随意互换。scDblFinder 作者的使用手册
准备对象时，先去掉明显空液滴，保留尚待质控的候选细胞和原始计数。若先按总分子数上限大幅过滤，可能恰好删掉了一批最容易辨认的双细胞，改变后续分类可以利用的证据。另一方面，成千上万含少数环境分子的空液滴也没有必要加入训练。记录每个物理捕获进入分析的条形码数、所用的细胞识别方法、装载和回收记录。特殊上样方案的双细胞先验应结合相应实验体系核实。
为什么两枚细胞来自同一类时更难识别
scDblFinder 会构造人造双细胞，把它们和真实条形码一起放进低维邻居空间，利用周边人工双细胞和其他特征训练分类器。若两枚来源明显不同，结合后的表达可能落在两种谱系之间，若两枚都属于同一类，它们相加后常仍靠近该类的正常细胞。表达强度高一些也可能来自一枚体积较大的真实细胞。因此总分子数有信息，却很难独自决定身份。scDblFinder 项目及方法说明
做一个纯教学的随机配对练习。假定悬液里五分之四是甲类型、五分之一是乙类型，双细胞的两次来源独立且等概率按这份组成抽取。两枚甲的概率是零点八的平方，甲乙混合的概率要记得乘二，因为甲乙或乙甲都是同一混合类别。下面得到的是在已发生双细胞这一条件下的来源构成，不能拿来当作全体液滴的双细胞率。
| 已知为双细胞时的来源 | 本例的计算 | 条件概率 |
|---|---|---|
| 甲与甲 | 0.8 × 0.8 | 64% |
| 甲与乙 | 2 × 0.8 × 0.2 | 32% |
| 乙与乙 | 0.2 × 0.2 | 4% |
在这个例子里，同类配对合计百分之六十八。算法若能辨认许多谱系冲突的甲乙混合体，漏检一部分看起来仍像甲的组合也有理由。真实捕获还受到细胞黏连和装载条件等影响，随机配对公式只能给诊断提供直觉。如果某种特殊组合远超随机预期，回看是否在解离后仍黏连，或是否来自真实细胞相互作用。要宣称真实相互作用，仍要有组织位置等独立线索，单靠数目偏多难以定论。
把高分细胞放回原来的捕获批次
下面例子假定对象带有原始计数和已经核实的捕获编号。输出既有连续分数，也有二分类结果。先生成按捕获列出的交叉表，再把分数同原始分子数、检出的基因数量和两组谱系标记结合查看。这里设定随机种子用于复核同一份分析，不同的并行设置还要按所用软件版本记录并行随机数配置。
library(scDblFinder)
stopifnot("capture_id" %in% colnames(SummarizedExperiment::colData(sce)),
!anyNA(sce$capture_id))
set.seed(101)
sce <- scDblFinder(sce, samples = "capture_id")
table(sce$capture_id, sce$scDblFinder.class)
预期双细胞率会参与阈值选择。不要把多个独立的小捕获当作一个超大捕获，再套用随细胞数增加的默认预期。相反，也不要为了让预测比例符合主观愿望而反复手调阈值。如果一个通道远高于其他通道，核对其上样量、混合步骤、实际回收数和死细胞情况，再查预测分数是有明显分界还是许多细胞挤在阈值附近。两种现象可能得到相同的预测率，但对逐个条形码判读的把握很不一样。
值得额外保留被叫作单细胞却总分子数很高的条形码。将这些细胞与同谱系、同捕获、相近质量的普通细胞比较，可以查同型混合是否值得进一步验证。不能凭它们没有超过分类阈值，就给整个类别作出排除双细胞的保证。
实跑经验｜看真值交叉表，先数清模拟器究竟造出了多少双细胞
我们在 R 4.5.2 中安装 scDblFinder 1.24.10，使用包自带的生成函数模拟两类细胞，分别输入二百二十和一百六十枚单细胞，保留四百五十个基因。把生成端的双细胞率参数设为零点一，并只产生由不同类型混合的双细胞。最终生成的对象有三百九十九列，其中三百八十枚为单细胞，十九枚为模拟双细胞。若直接用输入参数乘以总数来写期望真值，就会算错这次实际交给程序的对象。我们把模拟器的真实类别留到最后才打开，拟合时给定先验比例零点一，按单一捕获使用单进程。
实际分类结果将十九枚已知双细胞全部标出，同时将三枚已知单细胞标成双细胞。以本次被标出的二十二枚为分母，阳性预测值约为百分之八十六点四。若换成十九枚已知双细胞为分母，召回率则为百分之百。两项数字不能互换。本次特意排除了同类型混合，因此这张表无法告诉我们真实骨髓样本中同类双细胞的识别水平。可以把这两种分母保留在自己的验证报告里，并给同类、跨类以及是否有独立标签分别列一行。
怎样处理会影响科学结论的稀有群
在待查小群中逐细胞看两套标记是否同时高表达，而非一半细胞表达甲标记、另一半表达乙标记，合起来的平均图才显得“双阳”。再分别和最可能的两个来源群比较，查这群细胞是否只是两边标记的叠加，还是还具有独特、协调、在不同供体重复出现的发育程序。根据实验设计，可用样本标签、不同供体的基因型信息或蛋白共表达作独立检查。基于供体身份的办法能识别不同供体混合，却无法识别同一供体的全部双细胞，应交代验证能覆盖哪一部分。
最后跑两套下游分析，一套剔除所有预测双细胞，另一套把有实验证据、但分数接近阈值的候选另行标记并保留。比较稀有群是否仍存在、关键标记和供体组成是否稳定。若一项核心结论只由一两枚边界细胞支撑，应把它列为待验证候选。这样既不会因为一个分数抹掉可能的生物发现，也不至于把混合液滴写成一条新谱系。
交付时保留每枚细胞原始分数、最终标签、所属捕获和人工复查理由，实验组就能具体追问某个条形码为什么被排除。持续接收多批液滴数据、需要让不同分析人员复用同一质控流程时，可了解云生信的生物信息分析服务器。
