单细胞算法边界与售前准入培训 · 第 1 篇 / 共 3 篇
不能因为客户只有1v1单细胞数据，就默认推荐一套“三虚拟”或其他进阶分析。是否推荐，要同时看独立样本数、目标细胞的数据质量、算法所需输入，以及客户想得到什么结论。进阶算法可以提供线索，但不能补回实验设计中缺失的重复。
本篇供售前技术老师培训使用。下面的推荐分级是项目沟通建议，不是所有软件通用的官方准入门槛。
一、先问清楚：客户说的“1v1”到底是什么？
最需要警惕的是：一组只有1个独立个体，另一组也只有1个独立个体。这时组别与个体身份混在一起，观察到的差异可能包含个体、取材或批次差异，难以推广成稳定的群体结论。[1][2]
但“两个Seurat对象”“两个文库”不一定等于两个个体。一个对象可能装有多个可追溯供体；同一人的多份文库、不同区域或大量细胞，也不自动变成多个独立个体。先核对供体ID、分组、取样、配对关系和批次，再判断设计。
如果是同一人的处理前后各一份，只能描述这一位受试对象的变化。配对有助于明确比较关系，但一对样本仍不能估计不同个体之间的变异。混样后若无法区分供体，也不能只按混入人数计算可用于统计的独立观测。
二、能做什么，要按结论层级说明
| 客户要做的事 | 可以怎样承接 | 必须说清的边界 |
|---|---|---|
| 质控、聚类、注释、表达展示 | 可以评估并开展，交付这批样本的细胞图谱和质量说明。 | 注释与亚群划分仍需证据；一份图谱不代表整个疾病群体。 |
| 比较两份样本的细胞构成和表达 | 作为描述性或探索性比较，关注差异幅度、方向及候选线索。 | 不能把大量细胞计算出的很小P值，包装成有生物学重复支持的组间差异。 |
| 虚拟敲除、共表达网络等 | 目标细胞、基因信号和方法前提合适时，可评估有限范围的候选探索。 | 算法能运行，不表示发现对其他个体也成立；独立验证仍需要安排。 |
| 用scPagwas补充遗传证据 | 只有存在合适的外部GWAS、参考资源和表达数据时，才值得进一步评估。 | 它回答遗传性状相关的细胞线索，不能替客户的1v1比较补齐重复。 |
| 证明某基因导致疾病，或某药能治疗 | 先把目标改为候选筛选与验证设计，明确后续证据需求。 | 计算预测、共表达和相关性均不能单独完成机制或疗效证明。 |
可向客户解释：当前资料仍有探索价值，关键是把交付目标写成“找哪些值得验证的线索”，而不是把软件输出直接写成已证实结论。
三、这几种“补救办法”，并没有补上重复
| 常见说法或问题 | 为什么不够 | 建议措施 |
|---|---|---|
| “每组有一万细胞，相当于很多重复。” | 细胞来自同一个体时，共享个体背景；细胞多和个体多解决的是不同问题。 | 把细胞数量和独立样本数量分别列出。需要群体比较时，优先讨论补充独立样本。 |
| “把细胞随机分成3份，就变成3v3。” | 这是人为拆分的伪重复，没有新增独立生物学信息。 | 拆分可用于部分计算稳定性检查，不能作为新增生物学重复。 |
| “做pseudobulk或metacell就可以显著性检验。” | 按样本汇总仍是每组1个；metacell聚合也不会产生新供体。 | 区分汇总表达、网络估计与组间推断。缺少重复时降低结论层级。 |
| “批次校正完，就能确定是疾病效应。” | 当组别和批次、供体完全混杂时，软件无法凭空辨认各自贡献。 | 回看设计与质控；必要时补样本或做独立验证，不承诺算法消除全部混杂。 |
| “加入公共数据，就算把客户样本补齐了。” | 来源、组织、处理和平台差异可能引入新混杂。 | 先评估可比性；适合时作为外部验证或明确的联合分析，不能自动算作同一设计的重复。 |
四、前端先问这6项，再决定推荐范围
1. 每组究竟有多少独立个体？供体ID能否追溯？
2. 是否配对？不同组的取材、批次和处理是否一致？
3. 目标细胞在每个样本中各有多少，质控后还剩多少？
4. 目标基因有没有被可靠检测，现有注释是否可信？
5. 客户要的是探索候选，还是希望支持组间差异、机制或治疗结论？
6. 能否补独立样本、查找可比公开数据，或做后续实验验证？
不要只问“总共多少细胞”。假设两份数据一共2万细胞，但目标亚群在其中一份仅有几十个，网络分析仍可能不稳定；这里的数字是情景示例，不是某个算法的统一门槛。
五、怎样向客户说，既讲清价值，又不夸大？
“这两份数据可以先做质量评估、细胞图谱和候选探索。进一步分析要看目标细胞和基因信号是否支持。因为目前每组只有一个独立样本，结果更适合用于选择后续验证方向，不能仅凭细胞数量就推广成稳定的组间结论。我们可以先把最值得做的问题缩小，再讨论需要补哪些证据。”
遇到“三虚拟”这类服务简称，前端还应追问对应的具体算法、数据库、输入与输出。不同虚拟方法并非互相替代，也不能因为名字相近就打包推荐。下一篇会分别说明虚拟敲除、转录因子扰动和药物候选筛选的条件。
资料依据
官方参数与接口可能更新；实际承接时需核对采用版本。文中的项目分级和处理顺序为沟通建议。
- 单细胞差异分析与生物学重复：Squair 等原始研究
- 单细胞伪重复问题：Zimmerman 等原始研究
- scTenifoldKnk 原始论文：设计、物种与局限
- scPagwas 官方仓库：GWAS 与单细胞整合、版本说明
- hdWGCNA 官方单细胞教程：按样本和细胞类型构建 metacell
如需判断现有数据适合哪些分析，可先向云生信提供研究问题、物种、样本分组与目标细胞的数据概况。
