单细胞分析跑出了 UMAP，却不知道细胞分群是否可靠、下一步该做什么？先回到三个基础问题：留下来的细胞质量如何，细胞身份是否可信，组间比较能否支持研究结论。
1. 质控阈值要结合样本，不能照搬教程
在 Seurat 中，常见指标包括检测到的基因数（nFeature_RNA）、UMI 总数（nCount_RNA）和线粒体转录本比例（常记为 percent.mt）。建议按样本查看指标分布，再决定过滤范围；不能只凭一个线粒体比例阈值判断所有组织的细胞质量。基因数异常偏高还应结合双细胞检测进一步排查。具体操作可参考 Seurat 官方质控与聚类教程。
2. 聚类完成后，还需要核对细胞身份
聚类是在表达特征上划分细胞，注释则需要生物学证据。不要看到一个标志基因表达，就直接确定细胞类型；应结合多个标志基因、表达比例和组织来源综合判断。
同时检查各簇的样本构成：如果某个簇几乎只来自一个样本，要进一步排查技术批次、质量差异或个体特异性。UMAP 分得漂亮，只能作为观察线索。
3. 做疾病或处理组比较，要保留样本层面的信息
例如，想研究“处理后巨噬细胞的炎症状态是否改变”，应先确认注释，再在同类细胞中比较。来自同一样本的数千个细胞，不能简单当作数千个独立生物学重复。具备合适的重复设计时，可按“样本 × 细胞类型”汇总计数，开展 pseudobulk 差异分析，再解释相关通路；参见 Seurat 样本层面差异分析示例。
保存样本分组、过滤参数、注释依据、代码和软件版本，才能让结果方便复查，也便于后续深入分析。
根据当前卡点，选择合适的支持
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