如果已经知道某个空间点只有一种细胞，把它交给反卷积程序，结果还会出现另外两种细胞吗？这是检验 SPOTlight 特别值得做的一道题。输出的每一行都可以规整地加到一，但这只说明算法把结果表达成了比例。为了检验算法能不能分对，可以用单细胞参考构造几个来源明确的空间混合物，先看纯甲、纯乙和纯丙，再看比例已知的混合点。这样才能知道占比几乎相同的两块颜色，究竟反映了样本，还是当前设置本就难以把它们分开。
让标记给主题一个起点，再看模型学出了什么
SPOTlight 先用细胞类型标记给非负矩阵分解提供初始信息，学到一组基因表达主题以及细胞在这些主题上的表示。再利用参考类型与主题的对应关系，对空间观测做非负回归。非负的条件使估计不能靠一个很大的正值和另一个负值相互抵消，输出比较容易解释。但“甲类标记参与初始化”不等于最后某个主题只代表甲类。一个强烈增殖或应激程序可以在几种类型中同时出现，此时主题也可能跨类型。画结果之前，要把主题在不同真实参考类型中的分布单独看一遍。SPOTlight 在 Bioconductor 的方法与接口说明
标记列表最好保留基因、所属类型和权重三列，并记录它来自哪份参考。若某一类型的高权重标记全来自单个供体，它们可能标记这个人的样本处理条件。可以先比较不同供体中同名类型的表达方向，再筛出空间平台也确实能测到的标记。不能用在单细胞参考中非常特异、却在整张切片上从未检出的基因来解释空间分布。相似亚群可以暂时合并成较粗类别，之后用有足够独立证据的切片再尝试细分。
做一份知道答案的空间混合物
从参考中抽取计数，构造甲乙丙三个纯点，再构造已知甲乙丙贡献的混合点。小规模的第一轮可以用每类平均表达，按给定权重相加，观察接口和归一化是否按预期工作。第二轮则从未参加训练的供体中抽细胞混合，保留抽中的细胞编号和各自总分子数。后一种试验同时会遇到细胞大小与测序深度不同的问题，同样五枚细胞的分子贡献可能相差很大。比较结果时明确自己的真值是细胞个数、输入表达贡献，还是人为定义的合成系数。
| 验收位置 | 已知输入 | 优先检查 |
|---|---|---|
| 纯甲对照 | 只含参考甲类谱 | 其他两类是否仍得到较大比例 |
| 已知比例的混合点 | 甲乙丙按六、三、一混合 | 主导类型、比例顺序、各类误差 |
| 缺失类型对照 | 从训练参考里拿掉一个真实来源 | 残差与剩余类型权重怎样变化 |
除了比饼图，还要看哪些位置重建得差。作者的教程展示了如何按空间位置绘制残差平方和，捕捉模型较难解释的区域。把残差与测序深度、组织边缘、坏死区以及标记缺失的区域并排画，才知道接下来该查原始计数、参考覆盖，还是技术噪声。即使残差不高，两种高度相似的类型也可能互相替代，因此它不能作为某类绝对不存在的证据。不同预处理或拟合尺度下的残差值也不宜直接用同一数值定合格门槛。作者的肾脏教程与残差图
实跑经验｜三个纯点的最大分量都选对了，但从未接近一
我们安装 SPOTlight 1.14.0，在 R 4.5.2 中生成八十四个基因、六十枚参考细胞，甲乙丙每类二十枚。每类有二十个较高表达的基因，训练时从各自列表取十五个起始标记，用一条计算线程，迭代上限一百。空间点一共六个，由参考类型的平均谱按给定系数混合、放大并四舍五入。这个例子有意让正对照来自相同参考，优先观察方法在当前设置下的行为。为能检查小分量，我们将最低保留比例设为零。
在纯甲点上，预测甲、乙、丙分别约为 0.528、0.250 和 0.222。纯乙点中乙约为 0.545，纯丙点中丙约为 0.506。三个位置的最大分量都给了正确类型，但是没有一个纯点的正确类型接近百分之百。六个点、三个类型共十八个估计与设定比例相比，平均绝对误差约为 0.218。这里衡量的是比例差，如把 0.60 估成 0.40，就相差二十个百分点。这个结果只对应这份模拟、标记和参数，提醒我们在真实组织中讨论几个百分点的稀有群之前，先看自己的纯对照能把其他类型压到什么程度。
# fitted 为 SPOTlight() 的返回值，truth 的行名为点位、列名为类型
pred <- fitted$mat[rownames(truth), colnames(truth), drop = FALSE]
stopifnot(max(abs(rowSums(pred) - 1)) < 1e-4)
absolute_error <- abs(pred - truth)
colMeans(absolute_error)
同一个结果中，纯丙点和同时含三种来源的点都可能有三块颜色。把很小的扇区统一设为零，会让图显得干净，却也会隐去偏差的来源。更好的排查方法是先看两个最容易互相分走比例的类型，列出它们的标记重叠、对应主题和在纯对照上的非零误分。再移除共享标记或合并相近类型，完整重跑并比较已知混合物的误差。如果只在图形阶段调低透明度，拟合实际上没有改变。
回到真实切片，哪些点适合优先验证
挑选真实组织点时，一类选组织形态和独立标记都支持的相对单纯区域，一类选预期多类型接触的交界区。双方采用相同的底图尺度、最小显示比例和原始计数口径，再查看模型在各自区域容易把信号分给谁。若“稀有类”在所有纯对照里都出现约两成，而在肿瘤边缘恰好也是两成，就需要高分辨率标记或独立参考才能区分真实浸润与方法基线。对分辨能力实在不足的一对亚型，报告二者合计通常比各自报一个小数点后两位的比例更可核验。
保留参考细胞来源、标记权重、模型设置与纯点验收表，后续换一份参考时即可用相同问题检验改进。多切片项目需要重复训练主题、比较多套参考时，可了解云生信的生物信息分析服务器。
