拿到一张分支图，学生说颜色从左到右越来越深，说明右侧细胞发育得更晚。导师把图旋转半圈，同样一批细胞又成了“从右到左”。真正给拟时序赋予方向的是研究者选择的起点和模型学习到的图，而不是二维坐标的横轴。使用 Monocle 3 时，把根从哪儿来、哪些细胞能从根到达说清楚，往往比换一个更好看的配色更重要。
先把问题限定为同一候选谱系中的状态变化，例如在明确时间点取样的分化系统中整理早期到晚期的细胞。若把没有共同谱系依据的多种成熟细胞放在一起，程序同样可以给出一张图，但这张图很难单靠表达相似性证明一种细胞真的变成另一种。实验时间、谱系标记、追踪实验和已知的发育顺序，都可以用来支持或质疑起点。
区分表达图、主图和根细胞
Monocle 3 的常用顺序是预处理、降维、聚类，随后学习连接状态的主图，再指定起点给细胞排序。降维图上两个点靠近，表示在构造这张图所用的表示中较相似。主图则是在该结构上学习出来的路径。指定根之后，拟时序按细胞在图上相对于根的位置计算。它不是采样后的钟表时间。除非有单独的外部标定，不应将某两个数之间的差直接写成分化若干小时。Monocle 3 轨迹分析教程
有了实验时间也不能把最早时间点的所有细胞自动视为祖细胞。早期样本可能混有成熟残留细胞，后期样本也可能保留少量起始细胞。可以从最早的时间点先确定候选，再用一整组标记、细胞质量及所属分区进一步缩小范围。应尽量让根的选择独立于最后要验证的那条候选基因曲线，避免按结果挑最顺眼的起点，然后又拿同一曲线来证明起点选得对。
五个节点揭示方向从何而来
设有一个教学主图。甲连乙，乙连丙，丙分别连丁和戊，每条边长暂定为一。将甲设为根，从甲到乙是一条边，到丙是两条，到丁和戊都是三条。再保持同一张图，仅把根换到丁。此时距离依次变成甲三、乙二、丙一、丁零、戊二。丁与戊仍是两支，但对它们谁更“晚”的解释已经改变。真实图上使用的距离和细胞投影远比这个例子复杂，这里只演示为何同一形状可以获得不同的顺序。
| 作为起点 | 甲 | 乙 | 丙 | 丁 | 戊 |
|---|---|---|---|---|---|
| 甲 | 0 | 1 | 2 | 3 | 3 |
| 丁 | 3 | 2 | 1 | 0 | 2 |
这张表也解释了一个常见的写作错误。丁与戊离甲距离相同，只能说明在此图中距离相等，不能推出两条支路经历了相同的真实时间。沿某一支越来越高的基因，也可能来自细胞周期、应激或样本准备，而非这条支路的调控因子。先把轨迹位置与取材时间、供体、已知标记分别并排画出，读者才能判断色带所代表的生物学解释是否站得住。
有些细胞的拟时序为什么是 Inf
在默认按分区学习图的情形下，不同分区之间可能没有可走的路径。如果只在第一块图里提供根，另一块图里的细胞无法从这个根到达，拟时序可能显示为无穷值。不要为了让绘图函数接受输入，就把这些值替换成全体最大值。那样会把“没有路径”伪装成“时间最晚”，再做趋势拟合就可能造出一个完全由编码方式制造的末端群。
下面假定 cds 已完成降维、聚类和主图学习，元数据中已有研究者核实过的早期候选标记 root_ok。只在有生物学依据时把该列设为真，再给细胞排序。例子中的交叉表比一张彩色图更容易看出，未获得有限值的细胞是否集中在某一分区。order_cells 的参数与返回值
library(monocle3)
candidates <- colnames(cds)[which(SummarizedExperiment::colData(cds)$root_ok)]
stopifnot(length(candidates) > 0)
cds <- order_cells(cds, root_cells = candidates)
time <- pseudotime(cds)
table(partition = partitions(cds)[names(time)], finite = is.finite(time))
如果另一个分区有独立证据支持自己的起点，可以在其中也选根，然后分区解释。此时不同分区的零点来自不同细胞群，数轴不能自动并成一条共同的真实时间线。如果研究只针对第一条谱系，也可把第二个分区单独标记为本分析之外，并报告原因。对于具有明显批次隔离或包含多条无关谱系的数据，先查分区产生的原因，再谈是否应构建一条跨区路径。
选根时还有一个细节。如果把分叉后的两端细胞都列为根，主图本身仍可保持原样，但从最近起点计距离会把两端同时当作早期区域。可在上面的五节点小图上手算，将甲和丁都设为起点，乙离甲一步，丙离丁一步，戊距丁两步，甲和丁都取零。这个结果很容易画出连续渐变，但已不能回答“从甲出发哪条分支出现得较晚”。因此把全部早期样本机械地加入根名单之前，先查看这些候选落在主图的哪些位置，标记不同候选落在同一端还是相对的两端。
在选根和选分支之间做一次敏感性检查
实操时可以准备两套都有依据的根，一套仅取强早期标记的细胞，另一套适度放宽这个范围，同时固定同一张已学习的主图。对共同可达的细胞，比较组别顺序、关键基因沿程曲线和候选分支端点是否保持一致。若一点点改动就使重要结论倒过来，应保留这个结果，把“方向暂不确定”写出来。若两套都一致，仍要回到实际取材时间和独立标记复核，尤其要查某条支路是否几乎全部来自单一供体。
保存分析时，除了主图图片，应保留根细胞的条形码与样本来源、各分区可达细胞数，以及支持早晚顺序的外部依据。后来想复核某个候选基因时，可以先锁定同一支、同一批共同细胞，再检查在不同根方案下的趋势。这比直接拿两张不同数据子集、不同坐标和不同根的轨迹图比较可靠得多。如果多位同事需要在同一图谱上复跑这些对照，可了解云生信的生物信息分析服务器。
