pySCENIC 给一个转录因子打出高分，究竟是哪一步提供的证据？

单细胞热图上某个转录因子的调控子很亮，可一查表达，它自己的转录本并不多。很多人从这里开始怀疑输入出了错。看清 pySCENIC 的三个步骤，这两种现象就能分别解释。第一个步骤从不同细胞间的表达变化建立候选关系，第二个步骤借助顺式调控线索缩小候选范围，第三个步骤看保留下来的靶基因在某个细胞里是否集中排在前面。热图通常画的是第三步的结果。要决定后续实验该验证哪一条边，最好从热图反查回前两步。

从共表达候选边追到基序证据

设有一群免疫细胞和一群上皮细胞。转录因子甲和几十个上皮特征基因在上皮中都高，在免疫细胞中都低。即使甲没有直接调控所有这些基因，将两个谱系合起来建网，模型也可能给其中很多基因较高的重要性。这一步有助于发现成组变化的候选关系，但重要性不能直接当作结合强度、激活倍数或调控方向。固定感兴趣的谱系重新看，往往能发现一部分看似很强的边主要由谱系构成贡献。pySCENIC 的建网实例

接下来按调控因子及其候选目标组成模块，检查对应顺式区域的基序排名是否富集，再据此保留较有依据的靶基因。这里有两个容易漏查的交集。第一是表达矩阵的基因命名与转录因子名单的交集，第二是表达基因与排名数据库可识别基因的交集。若实验对象是小鼠，却混用人类的编号、注释表和排名库，即便运行结束，留下的网络也可能只覆盖很偏的一部分基因。记录交集大小、未匹配基因及使用的数据库版本，能帮助定位为什么熟悉的因子从结果里消失。软件与排名库格式说明

用两份基因排名读懂活性评分

假设甲的一个候选调控子仅含三个教学靶基因，分别用甲一、甲二、甲三表示。下面两枚细胞测到了相同一组基因，表里列出每枚细胞表达排在最前面的五个。比较时要在每个细胞内部把基因按表达排序，不能先给每个基因在所有细胞间排个名，再沿错误的方向计算。

在第一枚细胞中，从第一名开始逐个往下扫，累计命中数依次是一、二、二、三、三。第二枚为零、零、零、一、二。哪一枚富集更早，读者可以直接看出来。AUCell 在指定的靠前排名区间上衡量恢复曲线的面积，早出现的命中有更多机会贡献面积。表里的五名和累计数只演示原理，不能替代软件对真实基因全集、截断范围及权重的处理，也不应将表中命中数直接写成软件输出的活性分。

这个例子还说明，只看因子甲自己的那一行表达，回答不了整个调控子是否在某枚细胞中活跃。观察到靶基因集靠前，而因子自己的转录本较低，可以提出若干待检验的解释，比如该因子转录本漏检、靶基因共享另一种上游程序，或者细胞状态变化存在时间差。用蛋白水平及核内定位作补充，或在相关细胞中检查多个独立靶点，比立刻将整个调控子叫作“已激活的直接调控网络”更具体。AUCell 作者的评分教程

在比较不同组织时，还要核对这个调控子有多少靶点真的进入了两份表达矩阵。假设第一套面板能观测二十个靶点，第二套只覆盖其中五个。如果从各自的命中数直接推断第二个组织里活性下降，可能只是两个面板的可见范围不同。可先报告共同可测的靶点和各自独有的靶点，再在相同背景基因集合上重排并重复评分。若共有靶点太少，应优先描述覆盖限制，并回到测量更完整的数据验证。

看起来稳定的调控子，经不经得起换样本

先固定数据库、基因筛选和随机设置，在各供体中分别看靶基因检出情况，再问活性差异由哪些样本贡献。如果一位供体提供了绝大多数高分细胞，很可能比较的是供体、测序深度或细胞亚型构成。一个实用的对照是限制到同一谱系及相近的检出基因数区间，分别按供体画活性分布。这样仍然可能存在生物差别，但至少能看清单个超深样本有没有改变结论。

再换随机种子或按供体抽取细胞重建网络，比较同一转录因子的靶基因集合。例如第一次得到五十个靶点，第二次也是五十个，其中三十个重合，则交集是三十，并集是七十，交并比约为零点四三。这个数说明两次集合的重合程度，无法凭它断言某一条边的真假。继续区分是核心靶点始终出现、外围靶点波动，还是整份名单几乎更换。对于后续只能验证三条边的实验，这个区分直接影响选哪三条。

若存在两个能识别相似序列的同家族转录因子，看到同一基序富集也难以区分到底是谁结合。可把两者的表达、蛋白证据、已知细胞特异性及共有靶点放在一起检查。若实验目的是证明直接调控，可分别考虑针对候选因子的结合测定和扰动后的靶基因响应。前者为占位提供证据，后者为功能关系提供证据，两个方向的材料比再换一次热图颜色更能推进判断。

给同事交付结果时，至少应能从一个高分细胞追踪到该因子的靶基因表、支持该模块的基序和原始候选边，并标出用于评分的排名范围。这样的记录能解释为什么两个环境中同名的调控子可能实际采用不同靶点。需要在多个供体和不同随机种子上重复建网时，可了解云生信的生物信息分析服务器。