TransDecoder 7 实跑，完整 ORF、最长 ORF 和真实完整蛋白不是同一回事

转录本组装结束后，常见的下一步是预测开放阅读框。结果文件里出现一个完整标记，是否就能认定得到了完整蛋白？一条转录本上存在两个较长开放阅读框，是否总会保留更长的那个？这些问题不能只靠输出名称回答，需要把候选提取、编码证据筛选和最终报告规则分开看。

本篇实际安装并运行 TransDecoder 七点零点零，使用两条有固定版本的公共人类转录本，再构造截短、反向互补和双阅读框输入，完成四组对照。重点是理解工具如何筛选候选，以及哪些结果不能直接上升为生物学结论。人工衍生序列仅用于测试规则，不代表发现了新的剪接体、融合转录本或短肽。

先核对版本，旧教程的默认行为已经改变

七点零点零于二〇二六年十一月二日发布，调整了候选长度、编码筛选、起始密码子处理及每条转录本报告多少个阅读框等行为。仍按旧版本“默认至少一百氨基酸”“默认报告多个非重叠结果”的印象解释新输出，可能从第一步就产生偏差。

当前版本的候选最短长度默认为五十个氨基酸，无同源支持的候选通常需要通过编码分数与目标诱饵检验，默认 q 值门槛为零点零五。同时，每条转录本默认报告一个排名最优的候选，允许多个候选需要明确开启相应参数。七点零点零官方发布说明

本篇运行的是 Perl 实现。官方文档同时推荐新用户考虑 Python 实现 PyTransDecoder，但我们没有在这次实验中运行后者，不提供两者的实测速率比较。一个项目内应固定实现、版本和筛选规则，不宜将不同版本的默认结果直接混成同一张矩阵。

为什么这次小输入使用预设模型

TransDecoder 不只是寻找起始和终止密码子，还需要判断候选是否具有与编码序列一致的统计特征。完整转录组可以提供用于训练的序列，小到只有几条输入时，依靠这些条目重新学习模型并不稳妥。

本次只有七条输入，因此采用官方提供的哺乳动物预设。它提供编码模型、起始模型和相应阈值，适合这次来自人类参考序列的规则演示。输出中的预设 q 值表也表明，我们使用的是参考预设所提供的判定体系，并不是用七条序列独立建立了一套可靠的经验分布。TransDecoder 当前官方文档

真实项目应根据物种、序列数量、组装完整性和遗传密码选择路径。预设方便使用，却不能保证任意远缘物种都适用。尤其是存在不同终止密码子规则的生物，遗传密码设置本身就会改变开放阅读框的边界，不能仅依靠换一个预设名称解决所有问题。

输入来源和人为改动都公开

公共参考为 TP53 的 NM_000546.6 和 ACTB 的 NM_001101.5。脚本从 NCBI 获取固定版本记录，核对序列摘要，并按记录中的编码区坐标提取片段。TP53 编码区为一基制闭区间一百四十三到一千三百二十四，ACTB 为八十五到一千二百一十二。

我们保留完整 TP53 转录本，同时分别去掉其编码区前端九十碱基、后端九十碱基，以及两端各九十碱基。另把 TP53 编码区与 ACTB 编码区通过终止密码子间隔连接，构造双阅读框序列，再构造一个六十氨基酸片段和 ACTB 全转录本的反向互补序列。

每一种改动都有明确用途。截短输入检查边界与完整标签，双阅读框检查报告数量和排序，反向输入检查链限制，短片段检查候选提取与最终保留是否为同一步。它们不是生物样本，也没有进行同源数据库搜索、核糖体测序或蛋白质组验证。

TP53 固定版本记录 和 ACTB 固定版本记录 可用于核对来源。复现附件同时保留下载地址、摘要、坐标和所有衍生规则，避免把裁剪后的测试序列误当成原始公共参考。

安装后使用实际可用的入口

本次容器实际报告 TransDecoder 七点零点零。旧教程常用的候选提取命令在这个容器中不直接位于可执行搜索路径，但统一入口能够正常调用所需步骤。因此，发现旧命令不存在时，应先检查当前包装方式和帮助，而不是立即判断整个软件安装失败。

docker pull quay.io/biocontainers/transdecoder:7.0.0--pl5321hcbfc158_0
docker run --rm quay.io/biocontainers/transdecoder:7.0.0--pl5321hcbfc158_0 \
  TransDecoder --version

# 解压复现包后，在对应工具目录执行
python3 run.py ./practice

四组实际运行都使用同一份输入和哺乳动物预设。第一组搜索两条链，第二组仅搜索输入序列正向，第三组在正向搜索基础上允许多个非重叠候选，第四组在正向搜索基础上只接受完整候选。分别输出到不同目录，避免重复运行覆盖中间证据。

TransDecoder -t transcripts.fa --preset mammal -O both_strands
TransDecoder -t transcripts.fa --preset mammal -S -O sense_only
TransDecoder -t transcripts.fa --preset mammal -S \
  --retain_multiple_orfs -O multiple
TransDecoder -t transcripts.fa --preset mammal -S \
  --complete_orfs_only -O complete_only

四组都成功退出。我们同时读取中间候选肽文件、最终肽文件、坐标注释和预设 q 值表。只保存最后一份肽序列，会丢失“曾经找到候选，但被哪一步排除”的关键信息。

候选数量与最终数量不能混用

两条链都搜索时，中间文件共有四十五个候选，最终保留六个。仅搜索正向时，候选降为二十五个，最终五个。允许多个候选后，候选提取数仍为二十五，但最终增加到六个。只接受完整候选时，中间候选为十八，最终三个。

这些数字包含不同阶段的信息。链限制改变搜索空间，完整性设置也会影响候选集合，允许多个候选则改变同一转录本上最终能够报告多少条结果。不能把最终数量的所有下降都解释成编码分数变差，也不能把数量增加自动解释成发现了更多真实蛋白。

实际整理结果时，建议保留候选标识、所属转录本、方向、坐标、完整性、编码分数与筛选信息。随后按问题统计，例如多少转录本至少有一个候选、多少候选属于部分阅读框。直接把最终肽条数写成基因数量，会把异构体、多个候选和组装碎片混在一起。

六十氨基酸候选被找到，不等于最终保留

人工短片段含六十个氨基酸对应的编码序列及一个终止密码子，超过当前默认候选长度门槛。实际中间文件确实找到了这个完整候选，说明它没有在最初的长度搜索中消失。

但四组最终结果都没有保留它。对应预设 q 值为一，未满足当前选择条件。这展示了一个非常具体的区别，候选足够长、具有起止边界，只能让它进入进一步评估，并不能自动通过编码证据筛选。

同样，未保留也不能作为该片段绝无翻译可能的证明。这是对一条人为裁剪序列、特定预设和规则的计算结果。若研究目标本来就是短开放阅读框，需要结合独立证据评估候选，而不是单纯降低长度门槛后把新增条目全部当成短肽发现。

q 值还应按其统计用途解释。它帮助控制某类筛选结果中的错误发现，不能直接读成每条候选“有百分之多少概率是真蛋白”。本次一些长候选的预设 q 值为零，也不意味着其所有结构和生物学功能都已经被证明。

双阅读框输入为什么保留较短的那条

人为连接的双阅读框序列中，前一段对应三百九十三氨基酸的 TP53 候选，后一段对应三百七十五氨基酸的 ACTB 候选。两者都能够通过本次筛选，但默认只报告后一段较短的候选。

实际输出中，前段编码分数约为一百零三点二九，后段约为一百一十一点六四。本次没有提供同源证据，排序依据中的编码分数先于长度，因此不是简单地保留更长者。加入允许多个非重叠候选的参数后，两段都进入最终结果。

这对解释真实组装很有用。若一个转录本只输出一个蛋白，不能据此断定它只含一个可识别阅读框。若输出多个蛋白，也不能立即断定存在多顺反子翻译。真实数据还可能包含嵌合组装、未分开的相邻基因或其他异常，需要回到读段和结构证据。

编码分数本身也不能充当功能强弱或者表达高低的指标。它服务于候选筛选和排序，不是蛋白活性测量。把这个分数与 TPM 或实验效应量放在同一条解释链上，容易赋予它本来没有的生物意义。

截去前端之后，为什么仍然标为完整

这是本次最值得警惕的结果。我们从 TP53 编码区开头明确删除了九十碱基，但最终输出仍把一个候选标为完整。该候选从裁剪后序列的第二十八碱基开始，到终止位置结束，最终为三百五十四氨基酸，比完整参考的三百九十三氨基酸短。

原因是完整标签描述当前预测阅读框是否具有相应起止边界，并不证明它覆盖了参考蛋白的全部原始位置。序列内部的起始密码子可以形成一个边界齐全的较短候选。此时，仅根据标签筛选“完整蛋白”，仍然可能保留已经丢失前端的模型。

开启只接受完整候选也没有解决这个问题，那条较短候选仍然被保留。相反，去掉后端的输入因为缺少相应终止边界，被报告为部分阅读框，并在完整性限制组中被排除。完整性过滤遵循当前候选的结构定义，不会自动恢复我们在输入中删除的碱基。

真实分析中应进一步比较同源蛋白覆盖、关键结构域和起始位置，并查看转录本是否本来就被组装截短。若一个关键蛋白比同源序列短很多，即使标签显示完整，也值得回查。对于天然存在短异构体的基因，又不能反过来把所有较短候选都判为错误。

链方向限制必须建立在已知方向上

反向互补的 ACTB 输入在两链搜索组中恢复了正确方向上的三百七十五氨基酸候选。仅搜索输入正向后，这个结果不再出现。软件没有丢失文件，而是我们主动限制了允许搜索的方向。

因此，正向限制适合已经明确转录方向的输入。它不能简单对应“原始测序第一端是正链”，也不能只因为候选数量减少就认为筛选更严格、更可靠。组装后的序列是否已按转录方向排列，需要由实际流程和证据确认。

这一对照也说明，相同的核酸内容换一个方向表示，可能在受限搜索中产生不同结果。保存序列版本和方向信息，与保存参数一样重要。跨项目整合候选时，至少应确认输入方向和搜索范围一致，再比较某些蛋白是否缺失。

输出文件怎样服务后续分析

最终肽文件适合用于蛋白层面的同源或结构域分析，编码核酸文件保留对应核苷酸序列，坐标文件用于把候选放回输入转录本。若输入来自基因组注释提取的转录本，转录本坐标与基因组坐标还需要正确转换，不能直接混用。

候选文件、最终文件和筛选记录最好一起归档。这样发现某条结果缺失时，可以区分没有搜索到、存在候选但未通过、被同一转录本上的其他候选取代，还是被方向或完整性规则排除。这种可追溯性比单纯保留一个最终蛋白数量更有价值。

本次没有执行外部同源和结构域搜索，因此不声称任何候选获得了这些证据。正式研究可以根据问题补充，但应把计算预测、数据库支持和实验验证分别表述。尤其是短候选和异常连接来源的候选，更需要明确哪些证据已经存在，哪些仍然缺失。

实跑后的判断

TransDecoder 的优势是把阅读框搜索、编码特征、起始位置和可选同源支持组织成可追查的预测流程，适合转录本组装后的候选编码区整理。限制在于模型依赖输入、物种背景和设置，输出边界完整并不保证参考覆盖完整，保留一个最优候选也不代表其他候选不存在。

这次四组实跑给出三个能够直接迁移的检查动作。先区分候选文件与最终文件，再检查同一转录本的排序和保留规则，最后把完整标签放回原始序列与参考覆盖中判断。这样读者看到一个完整阅读框时，能够知道它究竟证明了什么，以及还需要核对什么。

下载本组复现脚本和实际输出，其中包含公共记录摘要、所有人为改动、四组候选与最终序列，以及实际预设 q 值表。

当候选筛选规则已经明确，需要把多批转录本的预测、同源搜索和注释结果放在一致环境中处理时，可了解云生信生物信息学分析服务器服务。