FLAIR 实跑，剪接校正通过后，为什么异构体仍会被过滤

长读长 RNA 数据看起来能够直接读出整条转录本，但比对位置、剪接边界、截短和支持数量仍会影响最终结果。一个读段通过剪接校正，不代表它对应的异构体一定进入最终模型。反过来，最终没有某个模型，也不意味着原始数据中完全没有相关读段。

本篇实际运行 FLAIR 三点零点一的比对、校正和归并步骤，使用二十条人工长读段，分别检查校正窗口、补充连接表和最少支持数量。所有运行结果都保留到附件中。重点是追踪证据在哪一步被接受或排除，帮助读者解释最终模型数量为什么变化。

把三个阶段分开看

比对阶段把读段放到基因组上，并形成包含外显子区段的记录。校正阶段结合注释或补充剪接位点信息，处理偏移的边界并过滤无法核验的记录。归并阶段再把相容的证据组织成异构体模型，并检查支持数量与其他规则。

因此，每个阶段都有自己的输入对象和输出集合。原始读段数、校正保留数、候选模型数和最终模型数不能互相代替。若分析只留下最后一张表，某条候选为什么消失，往往就无法解释。

FLAIR 还提供其他分析路径，本次只运行上述三个模块，没有执行差异表达、融合分析或另一套整合流程。模块说明中的性能比较也不是这次实验测量的结果，不能直接拿来作为当前输入的实测结论。FLAIR 官方模块说明

二十条读段分别测试什么

人工参考包含三个外显子，一基制坐标分别为一千零一到一千四百、二千五百零一到二千九百、四千零一到四千四百。参考注释只写入完整的三外显子模型。我们从这个区域生成三类无测序错误的长读段。

第一类包含三个外显子，共十二条。第二类跳过中间外显子，连接第一段与第三段，共四条。第三类把第一外显子末端延长五十碱基，再接到第三段，共四条。第三类使用了参考注释之外的新供体位置，与第二类的已有位点新组合不同。

所有二十条序列首先实际完成基因组比对。随后，我们在其中四条已知结构读段的 BED 记录里，故意把第一外显子块长度增加三个碱基，模拟一个可以精确追踪的边界偏移。原始比对与修改记录同时保存，因此这些偏移不是本次比对器自然产生的错误。

这种设计能够测试校正规则，但不能估计真实长读长平台的错误率。重复生成的相同序列也不能当成独立生物学重复。读者应把它理解成一个知道输入真值的流程检查，而不是新的剪接发现或工具准确率排名。

安装后先看当前模块帮助

本次安装的容器实际报告 FLAIR 三点零点一，复现脚本锁定镜像摘要。软件帮助和固定版本源码中，补充连接表参数为 --junction_bed 或 --junction_tab，连接支持门槛为 --junction_support。这些入口与部分旧教程的写法不完全相同。

docker pull quay.io/biocontainers/flair:3.0.1--pyhdfd78af_0
docker run --rm quay.io/biocontainers/flair:3.0.1--pyhdfd78af_0 \
  flair --version

# 解压复现包后，在对应工具目录执行
python3 run.py ./practice

本次校正模块不接收旧示例中常见的基因组参数，而比对和归并步骤仍然需要参考序列。遇到参数不识别时，应先核对当前模块帮助，不要把另一个模块的参数直接搬过来。本次核对的固定版本校正入口

同一个短选项在不同模块里也可能含义不同。本次版本中，校正模块的窗口选项用于剪接位点校正，归并模块对应短选项则用于转录端点比较。记录命令时尽量保留完整参数名和模块名，能够减少复用脚本时的误解。

两个窗口怎样处理三个碱基的偏移

仅提供旧注释时，我们分别设置两个碱基和六个碱基的校正窗口。小窗口组保留十二条、排除八条。被排除的八条包括四条人为偏移记录，以及四条具有新供体位置的记录。

窗口扩大到六后，四条偏移记录被校正回注释边界，保留数变成十六。检查输出可见，第一外显子块恢复为四百碱基，后面的外显子区段保持预期位置。新供体位置距离旧边界五十碱基，仍然没有被这次窗口变化接纳。

flair align -g genome.fa -r reads.fa -o aligned -t 2

# perturbed.bed 由复现脚本在实际比对后生成
flair correct -q perturbed.bed -f known.gtf \
  --ss_window 2 -t 2 -o window2
flair correct -q perturbed.bed -f known.gtf \
  --ss_window 6 -t 2 -o window6

这不意味着窗口越大越好。本次知道四条记录被人为移动了三个碱基，所以能够判断恢复正确。真实数据中，相邻的剪接位点也可能都具有生物学意义，过大的校正范围可能把它们合在一起。参数的合理性需要结合误差分布、邻近位点和独立支持判断，不能只以保留条数增加为目标。

同样，保留条数减少也不自动代表分析更可靠。若真实位点未进入参考或者补充证据，合理读段也可能被排除。重要的是排除的对象是什么，缺的是哪一类证据，而不是把某一个比例当成普遍的质量分数。

新位点与已知位点的新组合不是一回事

在没有补充连接表的两组中，四条跳过中间外显子的读段都被保留。这些读段连接了已知第一外显子的末端和已知第三外显子的起点，两个边界本身已经能够在参考中找到，变化的是它们的组合。

另外四条读段把供体位置向后移动了五十碱基，这个新边界不在原参考中，因此仍然被排除。两种情况都可以产生参考之外的转录结构，却不具有相同的位点证据条件。

这个区别能够帮助理解工具关于新位点支持的要求。不能把“未提供额外位点证据”简单等同于“绝不可能输出任何参考之外的转录本”。阅读候选时应分别标注已有位点的新连接、新供体或受体位置、端点变化等情况，再决定需要怎样的验证。

补充表中的分数也是过滤条件

为了单独测试连接表的处理，我们人为写入一个新供体连接，分数字段固定为十。这张表是规则测试输入，没有来自真实短读长测序的证据，不能称为独立实验验证。真实项目应使用可靠的测序连接证据生成相应文件。

在这份表上，将连接支持门槛设为十时，新位点信息被接受，全部二十条记录通过校正。把门槛改为十一，表中这条连接不再满足条件，保留数回到十六，新供体相关四条再次被排除。

# 仅为规则练习构造表，分数 10 不是实测短读段支持数
printf 'chrToy\t1450\t4000\tfixture_new_donor\t10\t+\n' \
  > designed_junctions.bed

flair correct -q perturbed.bed -f known.gtf \
  --ss_window 6 --junction_bed designed_junctions.bed \
  --junction_support 10 -t 2 -o junction10

该表采用零基制半开区间。起点一千四百五十，对应前面外显子的一基制末端一千四百五十，而内含子第一个碱基为一千四百五十一。坐标体系混用时，哪怕只差一个碱基，也可能使本来清楚的位点关系变得异常。生成输入前，应对照一个已知连接手算转换是否正确。

还应区分连接表的分数、比对质量和最终异构体支持数。它们处在不同阶段，代表不同证据。本次表门槛十与后面的模型门槛三或五，并不是同一种量，不能为了让结果通过而相互替换。

二十条通过校正后，只留下一个模型也可能正常

我们把保留二十条的校正结果送入归并步骤，启用完整覆盖和剪接检查，并生成读段到模型的对应文件。第一组要求至少三条支持，第二组要求至少五条，其他设置保持一致。

门槛为三时，最终保留已知三外显子模型、跳跃模型和新供体模型，共三个。对应文件中，它们分别有十二、四、四条读段。门槛为五时，只剩具有十二条支持的已知模型，另外两个模型不再进入最终集合。

flair collapse -g genome.fa \
  -q junction10_all_corrected.bed -r reads.fa -f known.gtf \
  -t 2 -o support3 --support 3 \
  --stringent --check_splice --generate_map \
  --no_redundant longest --no_gtf_end_adjustment

这说明通过校正只是进入下一阶段的条件之一。最终集合受到模型支持门槛影响，没有报告的模型仍然可能在输入中有少量读段。这里的支持数也不能替代生物学重复，更不能直接形成差异剪接的统计结论。

本次还明确关闭参考端点调整，并为同一剪接链选择最长端点组合，目的是让人工设计的首尾位置容易核对。真实数据中的截短、降解和端点异质性需要另行评估，不应把这些选项当成所有实验通用的最优组合。

计数文件还列着三条，为何最终只有一条

在门槛为五的运行中，还有一个容易误读的细节。产生的异构体计数文件仍然列出十二、四、四这三组候选支持，但最终 BED、序列文件和读段对应文件只保留已知模型。

如果只数计数文件的行数，就会错误地报告最终得到三个异构体。本次实跑说明，该文件中的候选支持记录不能未经核对就当作最终输出集合。整理结果时，应以最终结构或序列文件的模型标识为基础，再关联对应计数与读段证据。

这个检查不复杂，却很有用。先提取最终模型编号，再确认用于统计的表是否包含这些编号之外的条目，并记录哪些条目因后续门槛被移除。不要把不同阶段生成的文件全部放进同一个文件夹后，凭名称相似就认为它们描述相同集合。

新编号不等于新基因

已知模型在结果中与参考基因编号对应，另外两个模型的名称带有读段标识和基因组位置。虽然名称形式不同，它们都位于同一个设计区域，并不因此变成两个新的独立基因。

解释真实结果时，需要把基因组位置、剪接链、端点和参考对应关系一起看。新连接、参考外模型和新基因是不同层次的说法。程序生成一个没有参考名称的编号，只能说明当前命名或对应规则没有给出相同标识，不能独立证明基因层面的新发现。

多样本分析还应明确怎样建立统一模型集合。各样本分别运行后，临时名称通常不能直接作为跨样本稳定键。使用一致的结构定义和可追查的对应表，才能避免将同一模型拆成多行，或把不同结构错误合并到一起。

优点、限制与这次实跑经验

FLAIR 的优势是把长读段比对、剪接核验和模型支持串成可检查的流程，允许结合参考和额外位点证据整理异构体。对于希望追踪候选为何被保留、为何消失的项目，逐阶段输出和读段对应文件很有帮助。

限制是结果依赖可用注释、位点证据、读段质量及过滤条件。校正可能消除误差，也可能在条件不合适时抹去真实差异。支持门槛可以减少低证据候选，同时也会排除真实但低丰度的结构。选择参数应围绕研究问题，保留能够解释取舍的证据。

这次一组比对、四组校正和两组归并全部完成。最值得迁移的经验，是分别核对位点是否有支持、偏移是否在校正范围内、候选是否达到最终门槛，以及统计文件是否对应最终模型。将这些层次分开，才能把“没有输出”转换成一个可以继续调查的具体问题。

下载本组复现脚本和实际输出，其中包括未改动比对、四条人为偏移、人工连接表、校正保留与排除记录，以及最终模型和读段对应结果。

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