ArchR 的峰能在两份伪汇总里重复，就能说有两名供体支持吗？

单细胞开放染色质数据很稀疏，把同一类型的细胞汇总起来，原来几乎看不见的局部插入信号会变得清楚。ArchR 利用这种思路建立分组覆盖文件，再识别一组可重复的峰。一份看似严谨的结果写着“该位点在两个重复中出现”，但实验记录里此类稀有细胞只来自一名供体。这不一定是软件出了错。问题在于，此处重复的是哪份材料、哪一次划分，以及它究竟能支持哪种结论。

把组成伪汇总的每个细胞追到样本

建峰前先做一个细胞类型乘供体的表，除了细胞数再列各格的有效片段数。两名供体同样贡献四十枚细胞，若其中一份片段深度只有另一份的几分之一，发现较弱开放位点的能力可能相差很大。对于稀有群，还要看这些细胞是否分布在多个样本，或是否全部来自一次解离。先确定想建立哪个层级的峰集，再选择按粗谱系、细分类别还是实验处理来分组。

ArchR 的分组覆盖函数可以利用样本标签划分伪汇总。传入的分组字段决定哪些细胞被放在同一类中，样本标签则有助于在类内利用来源信息。细胞很少时，项目内容和参数会约束能建立哪些重复，不能仅靠输出文件名推断这些重复来自哪些供体。建议归档每个重复里的细胞、文库和实际片段数，尤其要查两个文件是否共享来源或部分条形码。一个大群每个重复都很深的时候，从中学得的直觉未必适用于一个稀有群。ArchR 的伪汇总构建教程

用两个位点区分深度重复和生物学重复

假设教学数据里，甲供体的同类细胞很多，拆成甲一和甲二，乙供体单独形成一份覆盖文件。位点甲在甲一、甲二中都形成峰，乙没有形成峰。位点乙在甲一和乙中形成峰，甲二没有。若只数三个文件中有几个打勾，两个位点都得到二。若改数有几个不同供体提供过支持，位点甲只有一个，位点乙有两个。两种都值得留下，但应带着不同的证据说明进入后续分析。

表里的“未成峰”也不要写成“完全关闭”。峰调用要综合局部插入和背景，较浅的重复可能只有少量读段，尚不足以达到判峰标准。针对每一处候选，把相同基因组坐标上的原始分组覆盖画在同一纵轴或采用一致的归一化方式，并给出各组总片段数。若图自动为每一行单独调整纵轴，较小的波动和很强的富集都能填满整行，看起来很接近，读者却无法直接比较量级。

从分组覆盖生成峰集，再回到每个细胞计数

下面假设对象已有经过检查的细胞类型列和供体列，并已安装可用的 MACS2。先按细胞类型生成考虑供体标签的覆盖，再指定用同一分组名称生成可重复峰集。示例中的重复数用来说明参数含义，真实项目应检查参与建峰的覆盖文件，再判断这样的要求是否适用于每个组。最后构建逐细胞峰矩阵，供后续定量和可视化使用。峰调用的顺序 · 重复支持和峰数限制的参数

library(ArchR)
macs <- unname(Sys.which("macs2"))
stopifnot(nzchar(macs))
proj <- addGroupCoverages(ArchRProj = proj, groupBy = "CellType",
                          useLabels = TRUE, sampleLabels = "Donor")
proj <- addReproduciblePeakSet(ArchRProj = proj, groupBy = "CellType",
                               pathToMacs2 = macs, reproducibility = "2")
proj <- addPeakMatrix(proj)

在输出中找不到某一类细胞熟悉的调控区，可以按步骤逆查。先确认该类是否形成了足够的有效覆盖，再核对这个位点在各个独立重复里有没有被调用。若有原始峰而最终合并集合找不到原名字，查看是否与邻近峰重叠、被统一为新的边界或在限制保留峰数时落选。使用准确的参考基因组和坐标检索，比拿两个结果的行名直接求字面交集更可靠。若区域靠近被排除的染色体或低可比对区域，也要检查相应设置。

检查建峰偏向时，可以在深度较高的供体中按固定种子抽取一部分细胞，使其与较浅供体具有相近的细胞数，再分别报告总片段数。在相近细胞数下仍出现巨大覆盖差，说明单纯限制细胞数还没有对齐有效深度。若某位点在轻度抽样后就反复消失，应标出发现对测序深度敏感，避免把一次未通过峰调用直接写成供体特有。

在统一峰集上检验处理差异

假设处理组深、对照组浅，于是某个区域只在处理组找到了显著峰。这个现象可以提出处理相关开放的候选，还不能把两组分别是否过调用门槛当作差异检验。先构建有依据的共同候选区域，再从两组原始片段在同样的边界上定量。以每位供体为单位按设计做比较，同时检查深度、细胞构成和取材配对关系。若同一供体有处理前后样本，应保留配对信息。一名供体拆成多个伪汇总由此增加覆盖的稳定性，生物学样本数仍是一。

对于只有一个供体支持的稀有状态，可以做一次现实的追查。将该供体的细胞按可重复的方式分开，看局部峰是否只由一小撮异常高覆盖细胞贡献。再在其他供体同一范围内观察稀疏插入的位置与深度。如果第二名供体根本没采到这个状态，把它标为缺乏对应观察比写作“位点不开放”更准确。值得进入后续富集分析的峰，至少应能说明它是多供体复现、同一供体内稳定，还是仅有探索性证据。

整理最终文件时，保存伪汇总的细胞名单、各重复覆盖、统一峰集的参考坐标、调用设置和逐供体计数。以后有人争论“这个增强子在几个个体出现”，可以直接翻回支撑它的原始材料。多批图谱需要在相同参考上重建峰集并共享分组覆盖时，可了解云生信的生物信息分析服务器。