Cell Ranger ARC 同一个细胞核为什么有两个条形码？把 RNA 和 ATAC 配对查清楚

一份 10x Multiome 数据，表达矩阵和开放染色质矩阵各有几千个细胞。研究生把两个文库原始条形码直接取交集，结果几乎没有共同细胞，怀疑两种实验没有配上。这里值得先区分两件事。实验是否在同一枚细胞核上测量，与两个文库写在原始序列中的条形码是否逐字相同，是不同层面的问题。Cell Ranger ARC 的逐条形码表提供了已经配好的对应关系。顺着这张表查下去，还可以发现为什么“同一核的两个计数”不宜直接相加。

从实验设计找到可用的关联键

先确认拿到的是同一次针对相同细胞核的配对多组学实验。分别从同一供体做一份普通单细胞转录组和一份独立单细胞开放染色质实验，属于同一个人，却没有逐核对应关系。相同的组织标签、一样的上机日期、乃至偶然相同的一串条形码，都不能凭空给两种独立实验配对。先找回实验记录中的捕获编号、两份文库的配套关系和对应的分析输出目录。

ARC 的 per_barcode_metrics.csv 里有综合结果使用的 barcode、表达文库的 gex_barcode 和配对开放染色质文库的 atac_barcode。官方列说明中，表达条形码与综合键相同，开放染色质文库记录的是配对的那条序列。在同一份 ARC 输出里查一个细胞核，宜使用综合键连接其注释，再用表内映射定位两种文库原始信息。不同捕获之间则另加捕获编号作为联合键，避免白名单序列重复使用导致错误合并。10x 逐条形码质控字段说明

用三个虚构条形码查一次错配

设有如下教学数据。为方便阅读，条形码用短名字代替真实序列。甲捕获中，综合键甲一的表达侧是甲一，染色质侧是乙九。如果按两侧字符串完全相同去找，这枚有明确对应关系的细胞核就会丢失。另一个隐患是乙捕获也有综合键甲一，但它是另一枚细胞核，绝不能与甲捕获的甲一当作同一个观测。

下面的检查从一个捕获的 ARC 输出读取对应表，先保留被判定与细胞核关联的条形码，再查看两种测量。对多个捕获分别读取时，将示例里的捕获名换成实际编号，拼接后仍按两列一起判断唯一性。对于沿用匿名细胞名的下游对象，最好建立单独映射表，不要只凭行次序绑定元数据。

import pandas as pd

qc = pd.read_csv("outs/per_barcode_metrics.csv")
nuclei = qc.loc[qc["is_cell"].eq(1)].copy()
nuclei["capture"] = "capture_A"
assert not nuclei.duplicated(["capture", "barcode"]).any()
print(nuclei[["barcode", "gex_barcode", "atac_barcode",
              "gex_umis_count", "atac_fragments"]].head())

数字都叫计数，分子和切点各指什么

联合特征矩阵同一列对应同一个综合条形码，不同的行分成基因表达和染色质峰两种特征。表达行记的是分配给这个基因和条形码的去重分子数，峰行记的是归于这个峰和条形码的切点数。开放染色质片段还有两端，峰内片段数、峰内切点数和总片段数是不同的量。例如一条片段两个端点都落在某峰内，对这一峰可以贡献两个切点，但仍然只有一条片段。另一个片段若只有一端在峰内，它可以贡献一个峰内切点。10x 联合矩阵的两种特征和计数定义

若某核的一个基因记录两个分子，邻近峰记录四个切点，不能把两者相加解释为该基因有六份表达量。它们测量的是转录和染色质可及性，零值的含义也与两个实验各自的抽样深度有关。可以分析这些信号跨细胞是否共同变化，但任何关联都应先核对真实配对、谱系构成和测序深度。靠近基因的峰也未必直接调控该基因，尤其当多个细胞类型同时发生改变时，共同的谱系差别足以造成很强的相关。

还可抽取一个真实条形码，按特征类型分别给该列求和，再与逐条形码表中定义相符的字段核对。若比较的是所有有效片段与峰内切点，预期本来就不相等。先说明双方统计所用分母和区域范围，才能判断差异是正常口径还是读错了列。

用双模态质控决定哪些核适合哪个问题

画一个散点图，横轴为每核表达分子数，纵轴为每核有效染色质片段数，按捕获分别显示。观察两侧都充足、一侧明显偏低和两侧都弱的区域。若一整份文库的表达侧偏低，优先检查这一捕获的表达测序和样本处理。若只有特定谱系偏低，结合核的类型、总检出基因和开放染色质质量分布一起判断，不应仅因为它落在统一阈值以下就推断此类细胞完全不存在。

下游任务也会影响保留策略。要检验同一细胞内峰与表达的关系，通常需要双方都有足够信息的共同核。若计划先看单个模态中的稀有群体，可以另行保存该侧质量达标的细胞，但要在报告中明确哪些细胞没有进入配对分析。编制一个按捕获列出的筛选表，写明 RNA 达标数、ATAC 达标数、两者都达标数和最终进入分析的数目，比笼统写“保留五千个高质量细胞”更便于别人核实。

例如某捕获有一百个核，表达达标八十个、染色质达标七十个，如果共有六十个同时达标，至少一侧达标便是九十个。双模态分析应记录六十这个交集，以及另有二十个只满足表达、十个只满足染色质。单看八十与七十无法推出实际交集，更不能从两个矩阵的行列数恰好相等推断次序对齐。先核对共同键并明确选入的核，再计算相关系数，往往比事后解释奇怪的峰–基因连线有效。

一份便于交接的配对结果应能从任意核的名称追到原始捕获、两个文库条形码、各自的计数口径和过滤原因。团队需要反复处理配对文库、让同一套参考和质控表便于复用时，可了解云生信的生物信息分析服务器。