Baysor 分出九枚细胞就算正确吗？沿五百一十八个分子复核归属

做原位转录组分割时，团队经常先看彩色细胞图，再核对检测出的细胞总数。这个顺序很容易漏掉一种情况，细胞数完全相同，边缘处的转录本却被分给了不同对象。一个免疫标记如果只在某类细胞中多出几个分子，最后写成新表达状态还是邻近细胞信号，很可能就取决于这几次分配。我们用九团已知来源的分子和五十个背景分子实跑 Baysor，改变假定的细胞尺度，看计数、分子级误分和背景吸收怎样分别变化。Baysor 原始方法

把细胞边界问题换成一张分子归属表

输入表通常以每个检测到的转录本为一行，至少需要平面坐标和基因名。这里的“分子”是检测流程交给分割程序的记录，不能把同一细胞同一基因先求和成一行，再指望模型还原空间位置。开始前应保留分子标识、坐标单位、切片或视野归属以及质量过滤记录。每份数据只要能跟踪到原始分子，就能问某些分子是在换边界后归属改变、被列作背景，还是建模前就因质量被过滤出去。只保留最终细胞乘基因计数矩阵，这三种情况就难以区分。

尺度参数表达的是坐标单位下的近似细胞半径。若原程序以像素输出位置，而你测量的细胞宽度来自微米标尺，需要先换算，并区分半径与直径。一个实际宽度二十微米的细胞在图中横跨四十像素，若坐标仍用像素，其近似半径应按二十像素理解。不同形状、不同谱系的细胞尺寸也会变化。可以从目标组织中抽查不同大小的已知细胞，先估计合理范围，再留两端的参数做敏感性检验。把显微镜报告中一个以微米写的直径原样填入半径参数，既混了物理单位，也混了尺度定义。本次所用 C++ 发布版及参数入口

实跑经验｜总数不动，分子还能怎样换归属

我们安装并校验原作者发布的 Windows C++ 版本 Baysor 0.9.0。输入种子固定为三十七，九个中心按三行三列排布，最近中心间距十四个坐标单位。每个中心生成五十二个位置略有波动的分子，九个基因中有若干在各中心偏好出现。再将五十个均匀随机背景分子撒在整个视野，包括可能落入真实细胞附近的位置，所有记录随机打乱。这样一共有五百一十八行，空间重叠是按设计允许的。模拟真值只用于事后核账，实际运行使用位置和基因列，没有向模型提供真值标签或分割先验。

固定每个有效细胞至少十五个分子、三类分子组成聚类、一个线程和一百二十次迭代。两次仅改变近似半径，分别用三和八。两个输出都保留了五百一十八条分子记录，也都识别到九个有分子归属的细胞标识。四百六十八个已知来自细胞的分子在两次里全部得到某个细胞归属。然而半径为三时，五十个已知背景里有三十四个进了细胞，半径为八时有三十七个。若只报告细胞数和真实分子的分配率，两套结果看起来一模一样，背景吸收的变化则完全没有显露出来。

还可以按实际来源再查一遍。对于每个已知团，先取本团五十二枚分子中出现次数最多的预测标识，再数有多少分子去了其他标识。两次运行中各团的主要标识都互不相同，可以逐团对应真实中心。小半径共两枚偏离本团主要归属，大半径共八枚。输出标识本身会重新编号，直接逐行比较两次文件里的细胞编号文字是否完全相等，会把单纯改名也统计成分子迁移。应先用已知真值、共同分子或充分重叠的空间范围匹配对象，再比较归属变化。

baysor run -m 15 -s 3 --n-clusters 3 --threads 1 --iters 120 \
  --skip-ncv-color --count-matrix-format tsv --polygon-format none \
  -o scale3 molecules.csv
# 改用另一个输出目录，保持其余设置相同
baysor run -m 15 -s 8 --n-clusters 3 --threads 1 --iters 120 \
  --skip-ncv-color --count-matrix-format tsv --polygon-format none \
  -o scale8 molecules.csv

在原始分子表上再加一列“是否参与这项比较”也很重要。两次运行若用了不同的质量阈值或基因面板，先用唯一分子标识对齐共有记录，再额外报告只出现在一侧的记录数量。若将消失的记录自动填作未分配，尺度变化与输入过滤便会混成一种效应。

没有分子真值的切片，哪些位置值得优先复核

对真实组织，可以挑选两枚相邻但标记组合不同的细胞，分别画核轮廓、可用的膜染色以及几种代表基因的单分子坐标。对于在两套参数间换归属的分子，问它们是在细胞中心、细胞边界、胞突附近，还是组织空白区。若分歧主要发生在两种细胞的接触带，而决定跨谱系表达结论的恰好是这些分子，就应将它们标成边界不确定并展示对两个分割版本的敏感性。如果只是大片组织内所有对象统一改名，核对跨版本对象匹配以后再讨论生物变化。

可用外部分割作为先验时，先检查先验的实际覆盖层级。核区域通常比整枚细胞小，尤其在有伸长胞突或胞质很大的组织中，核图和细胞膜直接决定的区域会不一样。可选固定的一组分子，比较不提供先验与提供先验的两次运行，记录核内稳定归属和核外有争议的归属。某个细胞吸收了更多分子，既可能补回了真实胞质，也可能纳入了邻居，判断需要相应的图像和独立标记。原始论文讨论了借助分子组成与空间分布做分割的方法，可结合作者给出的示例检查数据环境。作者项目文档与示例

把分割用于差异表达或细胞通信前，最好交付逐分子分配表、每个细胞的计数与坐标、以及几个边缘位置的图像。这样当某个少量表达分子改变结论时，能够回到原始位置复核。需要在整批视野比较尺度与先验并保存逐分子结果时，可了解云生信的生物信息分析服务器。