QuPath 的大区域里明明有十个对象，为什么按子对象只数到四个？

在数字病理图像上先圈一大片组织，再在里面圈出核心区，是很常见的操作。按大区域导表，得到四个检测对象，而图上肉眼能数出十个，就有人怀疑检测过程丢了六个。另一个常见误会是，同一张视野换个格式导出，像素长宽未变，测得的每平方毫米密度却没有了。我们把十个位置固定的对象、两个嵌套矩形放进 QuPath 实跑，并把完全相同的像素分别保存成带物理标定的 TIFF 和普通 PNG。这个小项目可以分别复核对象层级和面积分母。

先区分图像、标注与检测对象

图像提供的是像素。标注对象可以表示组织边界、感兴趣区域或人工勾画的参考结构，检测对象则可以表示细胞核、细胞或其他被识别的实例。每个检测对象本身没有“每平方毫米”这样的量，要得到密度，必须先定义纳入的对象集合和区域面积。尤其当父标注内部嵌套子标注时，一个检测对象可以在几何上同时落入两个区域，在对象树里却只有一个直接父节点。问“这块组织有多少细胞”前，应先说明是数直接子对象、所有后代，还是中心点落在区域里的所有对象。QuPath 对象层级说明

对部分贴边的细胞，中心落在框内与轮廓只要相交就纳入，是两套不同规则。如果研究的是核中心密度，可事先规定按核中心归属。若研究的是阳性组织面积占比，更合适的统计对象可能是区域内部的像素面积。本文把所有检测对象都放在远离边界的位置，避免这项差异掩盖层级效果。换成真实切片后，推荐挑几枚跨越标注边界的对象手工对照，明确当前脚本的选择行为。将这种规则写进图注或结果表，后续跨视野复核才知道各列比较的是同一种量。

实跑经验｜同一枚检测可以落在大框内，又是小框的直接子对象

我们安装 QuPath 0.7.0，使用它自己的命令行脚本入口分别打开两张像素相同的图。在一百二十八乘九十六像素的画布上构建宽一百、高六十的大矩形，以及完全嵌在其中、宽六十、高四十的核心矩形。随后创建两行五列共十个椭圆检测对象，使用软件的层级解析功能安排归属。其中六个中心落在小矩形内，另外四个只落在大矩形内。十个对象是按照已知坐标放置的，本次考察的是区域归属与测量，没有用它来评价核检测算法的准确率。命令行运行图像脚本的官方用法

对大矩形读取直接子对象并只数检测类型，得到四。用大矩形几何范围测试所有检测的中心，得到十。对核心矩形，两种办法都是六，因为本例没有更深的第三层标注。若需要“核心以外的组织”，应明确是大区扣除核心的差集，不能仅凭大区直接子对象数恰好等于四，就认为对所有项目都等同于几何差集。实际项目若另有第三层标注、排除区或未解析的对象，这种巧合可能立即消失。

两份文件的像素内容逐值相同，TIFF 另存了每厘米两万个像素的标定。QuPath 读出水平与垂直都是每像素零点五微米。每个像素的面积要把两个方向的尺寸相乘，得到零点二五平方微米。六千平方像素的大区就对应一千五百平方微米，而非三千。无物理标定的 PNG 仍能给出六千平方像素和十个中心，我们把物理面积留空。若为了让报表看起来完整，直接把六千写进平方微米一栏，会将面积放大四倍，相应密度低估四倍。QuPath 图像像素与空间标定说明

def roi = annotation.getROI()
def calibration = getCurrentServer().getPixelCalibration()
def contained = getDetectionObjects().count {
    def det = it.getROI()
    roi.contains(det.getCentroidX(), det.getCentroidY())
}
def area = calibration.hasPixelSizeMicrons() ?
    roi.getScaledArea(calibration.getPixelWidthMicrons(), calibration.getPixelHeightMicrons()) : null
println([centerCount: contained, areaMicronsSquared: area])

一个密度值应如何配对分子与分母

在本次带标定的图上，整块区域的中心密度是十除以一千五百平方微米。核心区是六除以六百，外圈是四除以剩余的九百。换算成每平方毫米，三者分别约为六千六百六十七、一万和四千四百四十四。这些数只用于手算，因为本例的组织和细胞都是人为设置的。如果无意中拿大区的四个直接子检测去除以包含核心的大区总面积，就会得到约两千六百六十七。分子只覆盖外圈，分母却覆盖整块组织，这个数字在表格中很难仅凭大小识别。

还要小心重复汇总。若已经把整块组织的十个对象作为一行，又把核心的六个作为一行，两行相加得到十六，只能说明两个范围重叠，无法代表两块独立组织的对象总数。做队列统计时可以给每个视野和每个标注保存唯一标识及父标识，再专门标记区域之间是互斥还是嵌套。对真正互斥的小区汇总密度时，用全部纳入对象的总数除以全部有效面积，和简单平均各小区密度也可能不同。组织面积差异越大，这一步越值得在一两个已知视野上手算。

遇到截图、缩略图或经过裁切的导出图，应回查原始扫描标尺与导出比例，只有来源明确才能补充物理标定。在原图上测一个已知长度并与导出图并排比较，往往能发现缩放一半却仍在沿用原像素尺寸的问题。把输出保存成区域标识、父标识、直接检测数、几何纳入数、有效面积和面积单位几列，就能定位分歧来自对象层级、边界规则还是标尺。仅保存已经换算后的密度，往往会把三种问题都隐藏在一个小数后面。

需要将确定好的区域规则推广到成批全切片时，可以先保留上述小视野作为脚本复核样例。团队若需批量运行并保存对象测量结果，可了解云生信的生物信息分析服务器。