Manta 实跑｜体细胞 VCF 有 6 行断端，怎样还原成 3 对相连的位置？

用短读长数据检测结构变异，常会看到替代等位里出现染色体名、坐标和方括号。把筛选后的表按行数汇总，很容易把断端数报成事件数。我们运行了 Manta 的肿瘤与正常配对官方示例，体细胞结果恰好是六行，全部通过过滤。沿着每行的伙伴编号反查，六行只构成三对连接。其中一对还能看到两端坐标在字符串中相差两个碱基，另一对甚至没有裂分读段字段。这些细节决定了能否准确地说出断点的位置以及证据强度。

先决定要数的是端点、连接还是复杂事件

VCF 的断端记录只从连接的一侧写起。替代等位中的远端坐标和括号方向说明它怎样接向另一段序列，记录标识与伙伴标识则帮助找到另一侧对该连接的描述。想计算已配对断端数，可以按标识遍历并要求反向指回。想统计结构连接数，互指的一对只应贡献一次。若研究的是复杂重排，一个生物学事件可能包含多条连接，因此把六行还原成三对之后，还要另找证据判断这三对能否归入同一事件。VCF 规范中的断端与结构变异表示

Manta 输出的不同文件服务于不同用途。候选文件记录进入后续评分的候选，体细胞文件针对肿瘤与配对正常模式给出评分及样本支持。候选行的过滤值为点，通常表示该字段未给出过滤判定，不能写成已经通过。把候选集与体细胞集拼在一起按行统计，会把同一条连接的发现记录和评分结果都计入。读者应先确定要评估哪一种输出，再保留原始标识，以便回查前一阶段。Manta 用户手册中的结果文件说明

实跑经验｜六行的伙伴关系如何互相验算

我们安装 Manta 1.6.0，用发行包提供的 HCC1954 肿瘤及配对正常比对、局部参考和演示脚本实际跑完候选发现、评分和示例自检。结果与随包预期文件按示例规则比较通过。候选结构变异文件有六条，体细胞文件也是六条，全部属于断端类型。逐一要求一侧的伙伴编号在同一文件中存在，且另一侧的伙伴编号正好指回，两个文件都得到三对。小插入缺失候选文件和二倍体结构变异文件各有文件头，数据记录都是零条。这里检验的是教程所用的小范围，不反映整个样本的变异负担。Manta 官方发行包

第一对中的八号染色体记录写有伙伴十一号染色体的坐标，另一侧也能指回八号。肿瘤样本的读对字段是四百八十九和四，裂分读段字段是五百二十和十九。各自第一项是支持参考的数，第二项是支持替代连接的数。正常样本在两种证据上分别为三十二和零、二十八和零。本次两端把同一组数带了两遍，不能把四加四报成八对肿瘤支持，也不能把十九加十九当成三十八条独立裂分证据。若关心独立分子数，还要回查原始读段和模板关系，单凭这两列无法推出。

第二对最容易让坐标匹配脚本出错。八号一侧字符串里的远端坐标是十一号的九千四百九十七万五千七百四十九，伙伴记录自己的起点却是九千四百九十七万五千七百四十七。两侧都给出零到二的坐标偏移区间，以及长两个碱基的同源序列。短同源使等价的断点位置存在余地。若强制要求远端坐标等于伙伴行起点，明明互指的记录就会漏配。先以编号互指建立关联，再结合方向、同源序列和区间校验位置，能保留这一层信息。

pairs = set()
for key, record in records_by_id.items():
    mate = record.get("MATEID")
    if mate in records_by_id and records_by_id[mate].get("MATEID") == key:
        pairs.add(tuple(sorted((key, mate))))
print(len(pairs))

怎样向下游交付一个可核查的断点

第三对的两侧都落在十一号染色体。肿瘤中有十三对读段支持替代连接，正常样本该项为零。两端给出的坐标范围分别相对起点前后一百五十六和一百五十个碱基。此行格式中压根没有裂分读段字段，应写作“未报告”，不能填成实测零条。它的体细胞评分还是三对中最高的四十一，说明高评分与碱基级定位精度不是同一个指标。给后续实验设计引物时，要保留整个区间和方向，不能靠评分把一个较宽的断点范围缩成单一碱基。Manta 对同源、置信区间和支持字段的定义

做跨样本比较时，标识编号适合同一次调用内部配对，不能假设相同编号在另一个样本里指同一事件。可以保留双方染色体、方向和不确定区间，然后根据研究问题决定怎样匹配不同样本的连接。若两处断点在同一侧距离很近，但连接到完全不同的远端，只按一个坐标聚类会让它们混在一起。反过来，同源区的同一连接也可能在两次运行中采用略有偏移的位置。输出表同时保留两边，才有机会辨认这两类情况。

最后抽检一对有裂分证据的连接和一对主要靠读对的连接。分别查看肿瘤与正常样本的可比对性、局部覆盖、异常读对方向、跨接序列及两侧可能存在的重复。给每个连接一行摘要，同时保留两个断端的原始记录标识和过滤状态。历史项目尤其应记录版本与实际使用的参考，本例基于归档的上游发行包，能够复现随包示例这件事本身不能证明任一新样本的断点就已被验证。Manta 上游仓库与版本状态

要在整批肿瘤与正常配对数据上复跑这种断端核查，可使用云生信的生物信息分析服务器保存成对的原始证据与汇总结果。